如何選擇合適的蛋白染液的蛋白含量測(cè)定方法

　　對(duì)許多實(shí)驗(yàn)來說，確定蛋白樣品濃度是至關(guān)重要的。如果在2D電泳中，蛋白過多或過少，產(chǎn)生的后果都將是相當(dāng)嚴(yán)重的。大多數(shù)蛋白樣品可通過比色測(cè)定法定量。在典型的蛋白測(cè)定中，化學(xué)試劑加入到蛋白樣品溶液里產(chǎn)生顏色變化，這一變化可由分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀檢測(cè)，并與已知濃度的蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線作比較。Bio–Rad 提供了4種蛋白測(cè)定手段，每種都有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)。

　　Quick Start Bradford 蛋白測(cè)定是一種簡(jiǎn)單、精確的蛋白濃度定量方法?，F(xiàn)成的1倍濃度染料和7個(gè)預(yù)稀釋濃度(0.125、0.25、0.5、 0.75、1.0、1.5、2.0 mg/ml)的蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，讓你擁有現(xiàn)成的檢測(cè)工具。無需稀釋標(biāo)準(zhǔn)品和染料，一步完成蛋白濃度定量。

　　Bio–Rad 蛋白測(cè)定也是一種簡(jiǎn)單的蛋白濃度測(cè)定方法。該方法適應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)濃度測(cè)定、低濃度微量測(cè)定，或96孔板的快速測(cè)定。它的基本原理和流程和上面的Quick Start Bradford都是一樣的，不過要麻煩一點(diǎn)點(diǎn)。因?yàn)槌艘♂尩鞍讟?biāo)準(zhǔn)品，配成幾個(gè)不同濃度之外，還要稀釋染料，再過濾除去不溶顆粒。后面的步驟就沒有區(qū)別了，還有一點(diǎn)小差別就是價(jià)格。不過聯(lián)想一下奶粉和液體奶，就會(huì)想通了吧。

　　Quick Start Bradford 和Bio–Rad 蛋白測(cè)定方法的起源都是Bradford染料結(jié)合方法 (Bradford 1976)，該方法檢測(cè)考馬斯亮藍(lán)G–250染料與蛋白結(jié)合時(shí)(主要結(jié)合堿性或芳香族氨基酸殘基)的顏色變化。這種測(cè)定方法能定量多數(shù)蛋白或多肽(分子量> 3,000–5,000 Da)，操作簡(jiǎn)單、速度快，靈敏度高，與一些還原劑(如DTT、巰基乙醇)兼容。但有些去垢劑、黃酮、堿性緩沖液會(huì)干擾測(cè)定。

　　DC (Detergent Compatible) 蛋白測(cè)定是一種適用于含有去垢劑的蛋白樣品比色測(cè)定方法。該方法類似于常規(guī)的Lowry 測(cè)定方法 (Lowry et al.1951)，但經(jīng)過改良，節(jié)省了操作時(shí)間。DC 蛋白測(cè)定只需要15分鐘的溫育過程，而且吸光值讀數(shù)能保持2小時(shí)的穩(wěn)定。它可以兼容NaOH和多種去污劑，如10% SDS、2% NP-40、1% CHAPS、1% Triton X-100等，但還原劑還是會(huì)干擾測(cè)定。

　　RC DC (Reducing agent Compatible & Detergent Compatible) 蛋白測(cè)定是一種適用于含還原劑和去垢劑的蛋白樣品比色測(cè)定方法。以 Lowry 方法(Lowry et al.1951)為基礎(chǔ)的 RC DC 蛋白測(cè)定，具有原來DC蛋白測(cè)定的特點(diǎn)，并能與更多的試劑兼容，簡(jiǎn)化了復(fù)雜蛋白樣品溶液的定量測(cè)定。吸光值至少穩(wěn)定1小時(shí)。除了與DC 蛋白測(cè)定兼容的試劑外，RC DC 蛋白測(cè)定還與以下試劑和緩沖液兼容：2% CHAPS、350 mM DTT、0.1M EDTA、Laemmli 緩沖液、10% beta-巰基乙醇、ReadyPrep 抽提試劑等。

　　選擇合適的蛋白標(biāo)準(zhǔn)

　　大家可能從來沒有在意過蛋白標(biāo)準(zhǔn)，認(rèn)為不就是BSA嘛。其實(shí)不然。在蛋白測(cè)定中，最好的標(biāo)準(zhǔn)品是待測(cè)蛋白的純化制品。當(dāng)沒有這種絕對(duì)的對(duì)照蛋白時(shí)，可以選擇另一種蛋白作為相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)。如果是用Bradford方法測(cè)定，不同的標(biāo)準(zhǔn)品會(huì)導(dǎo)致同一樣品的結(jié)果差異較大，無可比性。因此在蛋白測(cè)定之前，最好是參照要測(cè)試的樣本的化學(xué)構(gòu)成，尋找化學(xué)構(gòu)成類似的標(biāo)準(zhǔn)蛋白作標(biāo)準(zhǔn)品。如果只需要相對(duì)蛋白濃度，那么任何一種純化蛋白均可作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)品。

　　Bio–Rad 提供兩種蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，小牛球蛋白和牛血清白蛋白(BSA)標(biāo)準(zhǔn)品。當(dāng)你用Quick Start Bradford和Bio–Rad 蛋白測(cè)定試劑盒測(cè)定蛋白濃度時(shí)，那么標(biāo)準(zhǔn)品的選擇就要慎重一些。如果你的樣品中主要含有白蛋白，那么BSA將是一個(gè)好選擇。如果你的樣品包含了多種蛋白，gamma-球蛋白可能更合適。而DC和RC DC蛋白測(cè)定就幾乎不受到標(biāo)準(zhǔn)品的影響，你愛選哪個(gè)選哪個(gè)。不過假如你想比較幾個(gè)蛋白的量時(shí)，最好還是用同一種標(biāo)準(zhǔn)品。

　　選擇合適的蛋白測(cè)定方法

　　正如一個(gè)硬幣的正反面，每種蛋白測(cè)定方法都有其優(yōu)缺點(diǎn)。當(dāng)你選擇一種蛋白測(cè)定方法時(shí)，需要考慮兩個(gè)重要因素：緩沖液的化學(xué)組成和檢測(cè)的蛋白量?；?Bradford方法的Quick Start Bradford和Bio–Rad 蛋白測(cè)定靈敏度高，可以兼容糖、巰基乙醇、DTT等。而對(duì)于去污劑和NaOH這兩種干擾Bradford測(cè)定的物質(zhì)，DC蛋白測(cè)定卻可以兼容。如果蛋白是在loading buffer中，準(zhǔn)備跑1D或2D電泳，或者剛從細(xì)胞裂解液中抽提出來，需要定量，那么RC DC蛋白測(cè)定更合適。下表總結(jié)了每一種蛋白測(cè)定方法的特點(diǎn)。

　　比色皿

　　最后還要提一下比色皿這個(gè)小東西。一般定量核酸和紫外定量蛋白，都是采用石英杯或者玻璃杯，但是不適合比色法測(cè)定蛋白質(zhì)。因?yàn)榉磻?yīng)中的染料(如考馬斯亮藍(lán))能讓石英和玻璃著色，所以必須采用一次性的塑料杯。而塑料杯一般不適合用于在紫外范圍內(nèi)測(cè)試樣品。Bio-Rad也提供了一次性的比色皿。這些比色皿可直接用于樣品的混勻，這樣你就省掉了轉(zhuǎn)移溶液的麻煩。而且比色皿所需的樣品體積只是標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)的一半左右，因此每個(gè)試劑盒的使用次數(shù)實(shí)際上變成了兩倍。另外，它的非光學(xué)面是凹槽設(shè)計(jì)，非常容易拿捏，而且不容易搞錯(cuò)，在光學(xué)面上留下指紋或在分光光度計(jì)中放反了方向。

　　蛋白定量這個(gè)看似簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)中，也蘊(yùn)藏了不少學(xué)問，所以還是要有一雙慧眼，來選擇最適合的試劑盒。