細(xì)胞培養(yǎng)基本條件

1、合適的細(xì)胞培養(yǎng)基

　　合適的細(xì)胞培養(yǎng)基是體外細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的最重要的條件之一，培養(yǎng)基不僅提供細(xì)胞營(yíng)養(yǎng)和促使細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的基礎(chǔ)物質(zhì)，而且還提供培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和繁殖的生存環(huán)境。

2、優(yōu)質(zhì)血清

　　目前，大多數(shù)合成培養(yǎng)基都需要添加血清。血清是細(xì)胞培養(yǎng)液中最重要的成分之一，含有細(xì)胞生長(zhǎng)所需的多種生長(zhǎng)因子及其它營(yíng)養(yǎng)成分。

3、無(wú)菌無(wú)毒細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

　　無(wú)菌無(wú)毒的操作環(huán)境和培養(yǎng)環(huán)境是保證細(xì)胞在體外培養(yǎng)成功的首要條件。在體外培養(yǎng)的細(xì)胞由于缺乏對(duì)微生物和有毒物的防御能力，一旦被微生物或有毒物質(zhì)污染，或者自身代謝物質(zhì)積累，可導(dǎo)致細(xì)胞中毒死亡。因此，在體外培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，必須保持細(xì)胞生存環(huán)境無(wú)菌無(wú)毒，及時(shí)清除細(xì)胞代謝產(chǎn)物。

4、恒定的細(xì)胞生長(zhǎng)溫度

　　維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)，必須有恒定適宜的溫度。

5、合適的氣體環(huán)境

　　氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。 細(xì)胞培養(yǎng)基種類與基本成分 細(xì)胞培養(yǎng)基的種類很多，按其來(lái)源分為合成培養(yǎng)基和天然培養(yǎng)基（目前使用的培養(yǎng)基絕大部分是合成培養(yǎng)基），按其物質(zhì)狀態(tài)分為干粉培養(yǎng)基和液體培養(yǎng)基兩類。干粉培養(yǎng)基需由實(shí)驗(yàn)者自己配制并滅菌，液體培養(yǎng)基由專業(yè)商家提供，用戶可直接使用，非常方便。

1、合成培養(yǎng)基的主要成分有：氨基酸、碳水化合物、無(wú)機(jī)鹽、維生素及其它輔助物質(zhì)：

　　氨基酸

　　氨基酸是組成蛋白質(zhì)的基本單位。不同種類的細(xì)胞對(duì)氨基酸的要求各異，但有幾種氨基酸細(xì)胞自身不能合成，必須依靠培養(yǎng)液提供，這幾種氨基酸稱為必需氨基酸。其中谷氨酰胺是細(xì)胞合成核酸和蛋白質(zhì)必需的氨基酸，在缺少谷氨酰胺時(shí)，細(xì)胞生長(zhǎng)不良而死亡。因此，各種培養(yǎng)液中都有較大量的谷氨酰胺。但是，由于谷氨酰胺在溶液中很不穩(wěn)定，應(yīng)置于-20℃冰箱中保存，在使用前加入培養(yǎng)液內(nèi)。已含谷氨酰胺的培養(yǎng)液在4℃冰箱中儲(chǔ)存2 周以上時(shí)，還應(yīng)重新加入原來(lái)量的谷氨酰胺。

　　碳水化合物

　　碳水化合物是細(xì)胞生長(zhǎng)主要能量來(lái)源，其中有的是合成蛋白質(zhì)和核酸的成分。主要有葡萄糖、核糖、脫氧核糖、丙酮酸鈉和醋酸等。

　　無(wú)機(jī)鹽

　　培養(yǎng)液中無(wú)機(jī)鹽的主要功能是幫助細(xì)胞維持滲透壓平衡。此外，通過(guò)提供鈉，鉀和鈣離子，幫助細(xì)胞調(diào)節(jié)細(xì)胞膜功能。培養(yǎng)液的滲透壓是一個(gè)非常重要的因素, 細(xì)胞通常可耐受260mOsm/kg ～320 mOsm/kg。標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液的滲透壓在此范圍內(nèi)波動(dòng)。特別注意：向培養(yǎng)液中加入其它物質(zhì)有可能會(huì)明顯改變培養(yǎng)液的滲透壓，特別是溶于強(qiáng)酸或強(qiáng)堿中的物質(zhì)。向培養(yǎng)液中添加HEPES 時(shí)需按以下方法調(diào)節(jié)鈉離子濃度。

　　大多數(shù)細(xì)胞所需pH 在 7.2 - 7.4。但是，細(xì)胞培養(yǎng)最適pH 值隨培養(yǎng)的細(xì)胞種類不同而不同。成纖維細(xì)胞喜歡較高pH (7.4 - 7.7), 而傳代轉(zhuǎn)化細(xì)胞系則需要偏酸pH (7.0 - 7.4)。  

　　由于多數(shù)培養(yǎng)液靠碳酸氫鈉（NaHCO3）與CO2 體系進(jìn)行緩沖，因此，氣相中的CO2 濃度應(yīng)與培養(yǎng)液中碳酸氫鈉濃度相平衡。如果氣相或培養(yǎng)箱空氣中CO2 濃度設(shè)定在5％，培養(yǎng)液中NaHCO3 的加入量為1.97g/L；如果CO2 濃度維持在10％，培養(yǎng)液中NaHCO3 的加入量為3.95g/L。

　　細(xì)胞培養(yǎng)瓶蓋不應(yīng)擰得太緊，以保證氣體交換。HEPES 是一種非離子緩沖液，在pH 7.2 - 7.4 范圍內(nèi)具有較好的緩沖能力，但是非常昂貴，在高濃度時(shí)對(duì)一些細(xì)胞可能有毒。HEPES 緩沖液可與低水平的碳酸鈉（0.34g/L）共用，以抵消因額外加入HEPES 引起的滲透壓增加。在這種培養(yǎng)條件下，細(xì)胞培養(yǎng)瓶的蓋子應(yīng)擰緊，以防止培養(yǎng)液中所需的少量碳酸鹽散入空氣中。大多數(shù)培養(yǎng)液中含有酚紅作為pH 指示劑，酸性培養(yǎng)液呈橙黃色，堿性培養(yǎng)液呈深紅色。

　　維生素

　　在細(xì)胞培養(yǎng)中，盡管血清是維生素重要來(lái)源， 但是許多培養(yǎng)基中添加了各種維生素以適合更多的細(xì)胞系生長(zhǎng)。

　　其它成分

　　在一些較為復(fù)雜的培養(yǎng)液中還包括其它一些成分。如在雜交瘤技術(shù)中常用的DMEM 培養(yǎng)液，使用時(shí)還需要補(bǔ)加丙酮酸鈉和2-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol，2-Me）。2-Me 對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有很重要的作用。有人認(rèn)為它相當(dāng)于胎牛血清，有直接刺激細(xì)胞增殖作用。2-Me的活性部分是硫氫基，其中一個(gè)重要作用是使血清中含硫的化合物還原成谷胱甘肽，能誘導(dǎo)細(xì)胞的增殖，為非特異性的激活作用。同時(shí)避免過(guò)氧化物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的損害。另一個(gè)重要作用是促進(jìn)分裂原的反應(yīng)和DNA 合成，增加植物凝集素(PHA)對(duì)淋巴細(xì)胞的轉(zhuǎn)化作用，已廣泛應(yīng)用于雜交瘤技術(shù)，另外，也開(kāi)始用于一些難以培養(yǎng)的細(xì)胞。2-Me 是一種小分子還原劑，極易氧化。分子量為78.13，純的2-Me 是一種無(wú)色有刺激味的液體，比重為

1.110-1.120(Do20)，常用終濃度為5×10-5M。常配制成0.1M 的儲(chǔ)存液，用時(shí)每升培養(yǎng)液加0.5ml。

　　液體培養(yǎng)基保存：

　　液體培養(yǎng)基應(yīng)于4℃冰箱避光保存，實(shí)驗(yàn)前放入37℃預(yù)熱。未加血清液體培養(yǎng)基有效期為12 個(gè)月。液體培養(yǎng)基中的L-谷氨酰胺會(huì)隨著儲(chǔ)存時(shí)間的延長(zhǎng)而慢慢分解。如果細(xì)胞生長(zhǎng)不良，可以再添加適量L-谷氨酰胺。

　　干粉培養(yǎng)基保存：

 4℃冰箱避光保存，有效期36 個(gè)月。

　　血清

　　細(xì)胞培養(yǎng)液中添加的血清有牛血清、馬血清、人血清等，其中牛血清是最常用的血清，分為胎牛血清和新生小牛血清。胎牛血清是從母牛破腹取出的胎牛中分離出的血清，價(jià)格昂貴。新生小牛血清是從剛出生的尚未哺乳的小牛中分離出來(lái)的血清，如廠家能做到這一點(diǎn)，新生小牛血清的質(zhì)量與胎牛血清的質(zhì)量相差不大。如小牛出生后已哺乳，從這種小牛中取出的血清中可能含有較多的生物活性物質(zhì)，其質(zhì)量明顯不如前兩種。

　　血清的質(zhì)量，種類及使用的濃度都有可能影響細(xì)胞的生長(zhǎng)，而不同批次的血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)的能力也不同，尤其是對(duì)克隆細(xì)胞的生長(zhǎng)，某些批次血清可能含有毒性或抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的物質(zhì)。因此，在購(gòu)買大量血清之前，必須對(duì)血清支持細(xì)胞生長(zhǎng)能力進(jìn)行檢測(cè)，然后再大量購(gòu)買質(zhì)量好的同一批號(hào)的血清，并注意以下幾點(diǎn)：

 （1）需要長(zhǎng)期保存的血清必須儲(chǔ)存于-20℃ – 70℃ 低溫冰箱中。4℃冰箱中保存時(shí)間切勿超過(guò)1 個(gè)月。由于血清結(jié)冰時(shí)體積會(huì)增加約10％，因此，血清在凍入低溫冰箱前，必須預(yù)留一定體積空間，否則易發(fā)生污染或玻璃瓶?jī)隽选?

 （2）一般廠商提供的血清為無(wú)菌，無(wú)需再過(guò)濾除菌。如發(fā)現(xiàn)血清有懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)液內(nèi)一起過(guò)濾，切勿直接過(guò)濾血清。

 （3）瓶裝血清解凍需采用逐步解凍法：-20℃ 至 -70℃ 低溫冰箱中的血清放入4℃冰箱中溶解1 天。然后移入室溫，待全部溶解后再分裝。在溶解過(guò)程中需不斷輕輕搖晃均勻（小心勿造成氣泡），使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。切勿直接將血清從-20℃進(jìn)入37℃解凍，這樣因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝集而出現(xiàn)沉淀。

 （4）熱滅活是指56℃, 30 分鐘加熱已完全解凍的血清。加熱過(guò)程中須規(guī)則搖晃均勻。此熱處理的目的是使血清中的補(bǔ)體成分（complement）滅活。除非必須，一般不建議作此熱處理，因?yàn)闊崽幚頃?huì)造成血清沉淀物顯著增多，而且還會(huì)影響血清的質(zhì)量。補(bǔ)體參與反應(yīng)有：細(xì)胞毒作用, 平滑肌細(xì)胞收縮, 肥大細(xì)胞和血小板釋放組胺, 增強(qiáng)吞噬作用, 促進(jìn)淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)生化學(xué)趨化和活化。

 （5）切勿將血清在37℃放置太久，否則血清會(huì)變得渾濁，同時(shí)血清中的有效成分會(huì)破會(huì)而影響血清質(zhì)量。

 （6）血清中的沉淀物絮狀物：主要是血清中的脂蛋白變性及解凍后血清中纖維蛋白造成，這些絮狀物不會(huì)影響血清本身的質(zhì)量?？捎秒x心3000rpm, 5 分鐘去除，也可不用處理。

　　顯微鏡下“小黑點(diǎn)”：經(jīng)過(guò)熱處理過(guò)的血清，沉淀物的形成會(huì)顯著增多。有些沉淀物在顯微鏡下觀察象“小黑點(diǎn)”，常誤認(rèn)為血清受污染。一般情況下，此小黑點(diǎn)不會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng)，但如果懷疑血清質(zhì)量，則應(yīng)立即停止使用，更換另一批號(hào)的血清。  

　　細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境

 1、實(shí)驗(yàn)室設(shè)計(jì)

　　細(xì)胞培養(yǎng)是一種無(wú)菌操作技術(shù)，要求工作環(huán)境和條件必須保證無(wú)微生物污染和不受其它有害因素的影響。細(xì)胞培養(yǎng)室和設(shè)計(jì)原則是防止微生物污染和有害因素影響，要求工作環(huán)境清潔、空氣清新，干燥和無(wú)煙塵。細(xì)胞培養(yǎng)室的設(shè)計(jì)原則一般是無(wú)菌操作區(qū)設(shè)在室內(nèi)較少走動(dòng)的內(nèi)側(cè)，常規(guī)操作和封閉培養(yǎng)于一室，而洗刷消毒在另一室。

 2、常用設(shè)施及設(shè)備

 （1）超凈工作臺(tái)：也稱凈化工作臺(tái)，分為側(cè)流式、直流式和外流式三大類。

 （2）無(wú)菌操作間：一般由更衣間、緩沖間和操作間三部分組成。操作間放置凈化工作臺(tái)及二氧化碳培養(yǎng)箱、離心機(jī)、倒置顯微鏡等。緩沖間可放置電冰箱、冷藏器及消毒好的無(wú)菌物品等。

 （3）操作間：普通培養(yǎng)箱、離心機(jī)、水浴鍋、定時(shí)鐘、普通天平及日常分析處理物

 （4）洗刷消毒間：烤箱、消毒鍋、蒸餾水處理器及酸缸等。

 （5）分析間：顯微鏡、計(jì)算機(jī)及打印機(jī)等。

 3、培養(yǎng)器皿

　　常用細(xì)胞培養(yǎng)器皿有培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、培養(yǎng)皿等。常準(zhǔn)備量是使用量的三倍。器皿應(yīng)選擇透明度好、無(wú)毒、利于細(xì)胞粘附和生長(zhǎng)的材料，常用一次性聚苯乙烯材料制品或中性硬度玻璃制品。常用的器皿有下面幾種。

 （1）液體儲(chǔ)存瓶：用于儲(chǔ)存各種配制好的培養(yǎng)液、血清等液體，常用規(guī)格有500ml、250ml、100ml 等幾種。

 （2）培養(yǎng)瓶：根據(jù)培養(yǎng)細(xì)胞種類要求不同培養(yǎng)瓶的形態(tài)各異，用于細(xì)胞傳代培養(yǎng)的細(xì)胞要求瓶壁厚簿均勻，便于細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)和觀察，瓶口要大小一致，口徑一般不小于1cm，允許吸管伸入瓶?jī)?nèi)任何部位，規(guī)格有200ml、100ml、50ml、25ml、10ml 等幾種。

 （3）培養(yǎng)皿：用于開(kāi)放式培養(yǎng)及其它用途。分直徑30mm、60mm、120mm 等幾種。

 （4）吸管：常用的有長(zhǎng)吸管和短吸管兩類，長(zhǎng)吸管也稱刻度吸管。其改良后管上部有球型刻度稱改良吸管，刻度吸管用于移動(dòng)液體。常用1ml 和10ml 兩種。短吸管也叫滴管，分彎頭和直頭兩種。

 （5）離心管：離心管是細(xì)胞培養(yǎng)中使用最廣泛的器皿，根據(jù)用途不同形態(tài)各樣，常用于細(xì)胞培養(yǎng)的離心管有大腹式尖底離心管和普通尖底離心管兩類。前者分別為50ml、30ml、15ml；后者則多為10ml 和5ml。

 （6）其它：如三角燒瓶、燒杯、量筒、漏斗、注射器等。

 4、細(xì)胞培養(yǎng)溫度

　　維持培養(yǎng)細(xì)胞旺盛生長(zhǎng)，必須有恒定而適宜的溫度。不同種類的細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)溫度要求也不同。人體細(xì)胞培養(yǎng)的標(biāo)準(zhǔn)溫度為36.5℃±0.5℃，偏離這一溫度范圍，細(xì)胞的正常代謝會(huì)受到影響，甚至死亡。培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)低溫的耐受力較對(duì)高溫強(qiáng)，溫度上升不超過(guò)39℃時(shí)，細(xì)胞代謝與溫度成正比；人體細(xì)胞在39-40℃1 小時(shí)，即能受到一定損傷，但仍有可能恢復(fù)；在40-41℃1 小時(shí)，細(xì)胞會(huì)普遍受到損傷，僅小半數(shù)有可能恢復(fù)；41-42℃1 小時(shí)，細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷，大部分細(xì)胞死亡，個(gè)別細(xì)胞仍有恢復(fù)可能；當(dāng)溫度在43℃以上1 小時(shí)，細(xì)胞全部死亡。相反，溫度不低于0℃時(shí)，對(duì)細(xì)胞代謝雖有影響，但并無(wú)傷害作用；把細(xì)胞放入25－35℃時(shí)，細(xì)胞仍能生存和生長(zhǎng)，但速度減慢；放在4℃數(shù)小時(shí)后，再回到37℃培養(yǎng)，細(xì)胞仍能繼續(xù)生長(zhǎng)。細(xì)胞代謝隨溫度降低而減慢。當(dāng)溫度降至冰點(diǎn)以下時(shí)，細(xì)胞可因胞質(zhì)結(jié)冰受損而死亡。但是，如果向培養(yǎng)液中加入一定量的冷凍保護(hù)劑（二甲亞砜或甘油），可在深低溫下如－80℃或－196℃（液氮）長(zhǎng)期保存。

 5、合適的氣體環(huán)境

　　氣體是哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)生存必需條件之一，所需氣體主要有氧氣和二氧化碳。氧氣參與三羧酸循環(huán)，產(chǎn)生供給細(xì)胞生長(zhǎng)增殖的能量和合成細(xì)胞生長(zhǎng)所需用的各種成分。

開(kāi)放培養(yǎng)時(shí)一般把細(xì)胞置于95%空氣加5%二氧化碳混合氣體環(huán)境中。二氧化碳既是細(xì)胞代謝產(chǎn)物，也是細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖所需成分，它在細(xì)胞培養(yǎng)中的主要作用在于維持培養(yǎng)基的pH 值。大多數(shù)細(xì)胞的適宜pH 為7.2-7.4，偏離這一范圍對(duì)細(xì)胞培養(yǎng)將產(chǎn)生有害的影響。但細(xì)胞耐酸性比耐堿性大一些，在偏酸環(huán)境中更利于細(xì)胞生長(zhǎng)。但有一些細(xì)胞也喜歡偏堿環(huán)境中生長(zhǎng)，如成纖維細(xì)胞最適合pH 是7.4-7.6。每種細(xì)胞都有其最適pH 值。  

　　細(xì)胞培養(yǎng)無(wú)菌操作基本技術(shù) 無(wú)菌操作技術(shù)分為三個(gè)部分：工作環(huán)境及表面的處理，細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的處理及培養(yǎng)液與培養(yǎng)細(xì)胞的處理。

　　工作環(huán)境的處理

　　使用層流超凈工作臺(tái)是最經(jīng)濟(jì)有效的手段。超凈工作臺(tái)正常工作時(shí)，向下的氣流可阻擋外界空氣污染物進(jìn)入超凈臺(tái)。

 （1）實(shí)驗(yàn)前，無(wú)菌室及無(wú)菌操作臺(tái)用紫外燈照射30-60 分鐘滅菌，用70% 酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，并開(kāi)啟無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才可開(kāi)始實(shí)驗(yàn)操作。每次操作只處理一株細(xì)胞，以免造成細(xì)胞交叉污染。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將實(shí)驗(yàn)物品帶出工作臺(tái)。如需要繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)實(shí)驗(yàn)，則用70% 酒精擦拭無(wú)菌操作臺(tái)面，再讓無(wú)菌操作臺(tái)風(fēng)機(jī)運(yùn)轉(zhuǎn)10 分鐘后，才可進(jìn)行下一個(gè)實(shí)驗(yàn)操作。

 （2）無(wú)菌操作工作區(qū)域應(yīng)保持清潔與寬敞，必要物品，如試管架、移液器或吸管頭等可以暫時(shí)放置，其它實(shí)驗(yàn)用品用完后應(yīng)及時(shí)移出，以利氣體流通。實(shí)驗(yàn)用品要用70%酒精擦拭后才能帶入無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)。實(shí)驗(yàn)操作應(yīng)在操作臺(tái)中央無(wú)菌區(qū)域內(nèi)進(jìn)行，勿在邊緣非無(wú)菌區(qū)域操作。

 （3）小心取出無(wú)菌實(shí)驗(yàn)用品，避免造成污染。切勿碰觸吸管與吸頭頭部或容器瓶口，不要在打開(kāi)的容器正上方操作實(shí)驗(yàn)。容器打開(kāi)后，用手夾住瓶蓋并握住瓶身，傾斜約45°角取用，盡量勿將瓶蓋蓋口朝上放在臺(tái)面上。

 （4）工作人員應(yīng)注意自身的安全，必須穿戴實(shí)驗(yàn)衣與手套后才進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。對(duì)于來(lái)自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心，并選擇適當(dāng)?shù)燃?jí)的無(wú)菌操作臺(tái)（至少兩級(jí)）。操作過(guò)程中，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑，例如DMSO 及TPA 等，并避免尖銳物品傷人等。

 （5）定期檢查下列項(xiàng)目：CO2 鋼瓶?jī)?nèi)的CO2 壓力；CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)的CO2 濃度、溫度、及水盤是否有污染；無(wú)菌操作臺(tái)內(nèi)氣流壓力是否正常，定期更換紫外燈管及HEPA 過(guò)濾器濾膜，預(yù)濾網(wǎng)﹙300 小時(shí)/預(yù)濾網(wǎng)，3000 小時(shí)/HEPA）。

　　細(xì)胞培養(yǎng)所用玻璃及塑料制品的清洗與消毒

　　清洗

　　在組織細(xì)胞培養(yǎng)中，體外細(xì)胞對(duì)任何有害物質(zhì)都非常敏感。微生物產(chǎn)品附帶雜物，上次細(xì)胞殘留物及非營(yíng)養(yǎng)成分的化學(xué)物質(zhì)，均能影響培養(yǎng)細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此對(duì)新使用玻璃器皿和重新使用的培養(yǎng)器皿都要嚴(yán)格徹底的清洗，且要根據(jù)器皿的組成材料不同，選擇不同的清洗方法。 玻璃器皿的清洗 組織細(xì)胞培養(yǎng)中，使用量最大的是玻璃器皿，故工作最最大的是玻璃器皿的清洗。一般玻璃器皿的清洗包括浸泡、刷洗、浸酸和沖洗四個(gè)步驟。清洗后的玻璃器皿不僅要求干凈透明無(wú)油跡，而且不能殘留任何物質(zhì)。

 （1）浸泡：初次使用和培養(yǎng)使用后的玻璃器皿均需先用清水浸泡，以使附著物軟化或被溶液掉。新的初次使用的玻璃器皿，在生產(chǎn)及運(yùn)輸過(guò)程中，玻璃表面帶有大量的干固的灰塵，且玻璃表面常呈堿性及帶有一些對(duì)細(xì)胞有害的物質(zhì)等。新瓶使用前應(yīng)先用自來(lái)水簡(jiǎn)單刷洗，然后用稀鹽酸液浸泡過(guò)夜，以中和其中的堿性物質(zhì)。再次使用的玻璃器皿則常附有大量剛使用過(guò)的蛋白質(zhì)，干固后不易洗掉，故用后要立即浸入水中，且要求完全浸入，不能留有氣泡或浮在液面上。

 （2）刷洗：浸泡后的玻璃器皿一般要用毛刷沾洗滌劑刷洗，以除去器皿表面附著較牢的雜質(zhì)。刷洗要適度，過(guò)度會(huì)損害器皿表面光澤度。

 （3）浸酸：清潔液是由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水按一定比例配制而成，其處理過(guò)程稱為浸酸。清潔液對(duì)玻璃器皿無(wú)腐蝕作用，而其強(qiáng)氧化作用可除掉刷洗不掉的微量雜質(zhì)。清潔液去污能力很強(qiáng)。是清洗過(guò)程中關(guān)鍵的一環(huán)。浸泡時(shí)器皿要充滿清潔液，勿留氣泡或器皿露出清潔液面。浸泡時(shí)間一般為過(guò)夜，不應(yīng)少于6小時(shí)。 清潔液可根據(jù)需要，配制成不同的強(qiáng)度，常用的下列三種：

　　重鉻酸鉀（g） 濃硫酸（ml） 蒸餾水（ml） 比例如下  

 （A）強(qiáng)清潔液 63∶1000∶200000  

 （B）次強(qiáng)清洗液 120∶200∶1000  

 （C）弱清潔液 100∶100∶100。

　　清潔液配制時(shí)應(yīng)注意安全，須穿戴耐酸手套和圍裙，并要保護(hù)好面部及身體裸露部分。配制過(guò)程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制過(guò)程中可使重鉻酸鉀溶于水中，然后慢慢加濃硫酸。并不停的用玻璃棒攪拌，使產(chǎn)生的熱量揮發(fā)，配制溶液應(yīng)選擇塑料制品。配成后清潔液一般為棕紅色。

 （4）沖洗：玻璃器皿在使用后，刷洗及浸泡后都必須用水充分沖洗。使之盡量不留污染或潔液的殘跡。沖洗最好用洗滌裝置。即省力、效果又好。如用手工操作，則需流水沖洗十次以上，每天水須灌滿及倒干凈，最好用蒸餾水清洗3-5 次，晾干備用。

　　膠塞的清洗

　　細(xì)胞培養(yǎng)中所用的橡膠制品主要是瓶塞。新購(gòu)置的瓶塞帶有大量滑石粉及雜質(zhì)，應(yīng)先用自來(lái)水沖洗，再做常規(guī)處理，常規(guī)清洗方法是：每次用后立即置入水中浸泡，然后用2% NaOH 或洗衣粉煮沸10-20 分鐘，以除掉培養(yǎng)中的蛋白質(zhì)。自來(lái)水沖洗后，再用1%稀鹽酸浸泡30 分鐘或蒸餾水沖洗后再煮沸10-20 分鐘，晾干備用。

　　塑料制品的清洗

　　塑料自制品現(xiàn)多是采用無(wú)毒并已經(jīng)特殊處理的包裝，打開(kāi)包裝即可用，多為一次性物品。必要時(shí)用2% NaOH 浸泡過(guò)夜，用自來(lái)水充分沖洗，再用5%鹽酸溶液浸泡30 分鐘，最后用自來(lái)水和蒸餾水沖洗干凈，晾干備用。

　　消毒

　　細(xì)胞培養(yǎng)的最大危險(xiǎn)是發(fā)生培養(yǎng)物的細(xì)菌，真菌和病毒等微生物的污染。污染主要是由于操作者的疏忽而引起，常見(jiàn)的原因有操作間或周圍空間的不潔，培養(yǎng)器皿和培養(yǎng)液消毒不合格或不徹底。由于有關(guān)培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)的失誤均能導(dǎo)致培養(yǎng)失敗，故細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)都應(yīng)嚴(yán)格遵守操作常規(guī)，防止發(fā)生污染。

　　消毒方法分為三類：物理滅菌法（紫外線、濕熱、干烤、過(guò)濾等），化學(xué)滅菌法（各種化學(xué)消毒劑）和抗生素。

 （1）紫外線消毒：用于空氣，操作臺(tái)表面和不能使用其它法進(jìn)行消毒和培養(yǎng)器皿。紫外線直接照射方便、效果好，經(jīng)一定的時(shí)間照射后，可以消滅空氣中大部分細(xì)菌，培養(yǎng)室紫外線燈應(yīng)距地面不超過(guò)2.5 米，且消毒進(jìn)物品不宜相互遮檔，照射不到的地方起不到消毒作用。紫外線可產(chǎn)生臭氧，污染空氣，試劑及培養(yǎng)液都有不良影響，對(duì)人皮膚也有傷害，不宜近照射。

 （2）溫?zé)嵯荆杭锤邏赫魵庀?，是一種使用最廣泛、效果最好的消毒方法。溫?zé)嵯緯r(shí)，消毒物品不能裝得過(guò)滿，以防止消毒器內(nèi)氣體阻塞而千百萬(wàn)危險(xiǎn)，保證其內(nèi)氣體的流通。在加熱升壓之前，先要打開(kāi)排氣閥門排放消毒器內(nèi)的冷空氣，冷氣空氣排出后，關(guān)閉排氣閥門，同時(shí)檢驗(yàn)安全閥活動(dòng)自如，繼后開(kāi)始升壓，當(dāng)達(dá)到所需壓力時(shí)，開(kāi)始記算消毒時(shí)間。

　　消毒過(guò)程中，操作者不能離開(kāi)工作崗位，要定時(shí)檢查壓力及安全，防止消毒及表皮意外事件發(fā)生。

　　常用物品消毒壓力及時(shí)間：

　　培養(yǎng)液、平衡鹽溶液及其它需要滅菌的液體：121℃, 15 磅, 20 分鐘；布類、玻璃制品、金屬器械等物品：先121℃, 15 磅, 20 分鐘，然后在烘箱中烘干；玻璃瓶：干熱滅菌170℃, 4 小時(shí)。

 （3）化學(xué)消毒法：最常見(jiàn)的是70%酒精及1‰的新潔而滅，前者主要用于操作者的皮膚，操作臺(tái)表面及無(wú)菌室內(nèi)的壁面處理。后者則主要用器械的浸泡及皮膚和操作室壁面的擦試消毒。化學(xué)消毒法操作簡(jiǎn)單、方便有效。

 （4）抗生素消毒：主要用于培養(yǎng)用液滅菌或預(yù)防培養(yǎng)物污染