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目錄：
第五章 常見(jiàn)組織細胞的培養方法
含 第一節 上皮細胞培養
第二節 內皮細胞培養
第三節 神經(jīng)細胞培養
第四節 肌組織細胞培養
第五節 巨噬細胞培養
第六節 腎小球分離、移植培養
第七節 裸小鼠移植瘤單細胞分離培養
第六章 腫瘤細胞的培養
含 第一節 組織培養腫瘤細胞生物學(xué)特性
第二節 培養方法
第三節 成纖維細胞排除法
第四節 提高腫瘤細胞培養存活率和生長(cháng)率措施
第五節 體外培養腫瘤細胞生物學(xué)檢測
第六節 對腫瘤細胞系或細胞株的評價(jià)
第五章 常見(jiàn)組織細胞的培養方法
體內組織細胞在體外培養時(shí)，所需培養環(huán)境基本相似，但由于物種、個(gè)體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同，各自要求條件有一定差別，所采取的培養技術(shù)措施亦不盡相同，現介紹個(gè)別組織細胞培養的要點(diǎn)如下:
第一節 上皮細胞培養
上皮細胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分，又由于癌起源于上皮組織，故上皮細胞培養特別受到重視。但上皮細胞培養中?；祀s有成纖維細胞，培養時(shí)生長(cháng)速度往往超過(guò)上皮細胞，并難以純化，同時(shí)上皮細胞難以在體外長(cháng)期生存，因此純化和延長(cháng)生存時(shí)間是培養關(guān)鍵。
體內上皮細胞生長(cháng)在膠原構成的基膜，因此培養在有膠原的底物上可能利于生長(cháng)，另外人或小鼠表皮細胞培養在以3T3細胞為飼養層（用射線(xiàn)照射后）時(shí)，細胞易生長(cháng)并可發(fā)生一定程度的分化現象。降低PH、Ca2+含量和溫度，向培養基中加入表皮生長(cháng)因子，均有利于表皮細胞生長(cháng)。
以表皮細胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養法可獲得純上皮細胞，其法如下（黑木凳志夫 1981）
1、取材：外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.5－1平方厘米小塊。
2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。
3、換入0.25%胰蛋白酶中，4℃過(guò)夜。
4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開(kāi)。
5、取出表皮，剪成更小的塊后，置0.25%胰酶中，37℃，30—60分鐘。
6、反復吹打，制成懸液。
7、培養：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后，低速離心，吸去上清。
8、直接加入培養基（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養瓶，CO2溫箱培養。
第二節 內皮細胞培養
內皮細胞易于從大血管分離培養成單層細胞，對于研究?jì)绕ぜ毎偕?、腫瘤促血管生長(cháng)因子（TAF）等有很大價(jià)值。
研究人內皮細胞培養以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡(jiǎn)便，其法如下：
1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無(wú)菌剪取10—15厘米長(cháng)一段，如不能立即培養，可于12小時(shí)內保存于4℃。
2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線(xiàn)繩扎緊，以防液體返流。
3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶，充滿(mǎn)血管，消化3—10分鐘；注入口用線(xiàn)繩扎，以防液體返流。
4、吸出含有內皮細胞的消化液，于離心管中，注入溫PBS輕輕反復沖洗后，一并注入離心管中（此步驟可重復）。
5、離心去上清，加入RPMI1640培養液制成細胞懸液，接種入培養器皿中，置溫箱培養。兩至三天可見(jiàn)細胞長(cháng)成單層。
第三節 神經(jīng)細胞培養
神經(jīng)細胞（神經(jīng)元）不易培養，只有在適宜情況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長(cháng)因子和膠質(zhì)細胞因子時(shí)，可出現一定程度的分化，長(cháng)出突起等現象，但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中比較容易培養的成分。
人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養，不僅能獲得生長(cháng)的膠質(zhì)細胞，也可形成能傳代的二倍體細胞系。一般說(shuō)來(lái)，膠質(zhì)細胞在培養中生長(cháng)不穩定，不易自發(fā)轉化，但對外界因素仍保持很好的敏感性，可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉化。
一、設備： 無(wú)菌操作設備。
二、大型設備CO2 培養箱：恒溫5%、10%CO2維持培養液中pH值。
倒置顯微鏡：用于每天觀(guān)察貼壁細胞生長(cháng)情況。
解剖顯微鏡，用于準確地取材。
常溫冰箱：-4℃，用于保存各種培養液，解剖液和鼠尾膠。
低溫冰箱：-20℃--80℃，用于儲存血清酶，貴重物品和試劑。
電熱干烤箱：用于消毒玻璃器皿。
高壓消毒鍋：用于消毒培養皿，手術(shù)器械。
過(guò)濾器：配制解剖液、培養液，必須過(guò)濾后才可使用，以去除細菌。
滲透壓儀，pH劑，天平等。
三、培養器皿及手術(shù)器械
1、培養皿：常用35mm塑料及玻璃皿，解剖取材用15mm-90mm直徑。
2、培養板，24-40孔，可用于開(kāi)放培養。
3、培養瓶：
4、吸管，常用1，5，10ml，均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。
5、各類(lèi)培養液貯存器。
6、小型手術(shù)器械。
準備：
1、配制培養液
（1）解剖液：以無(wú)機鹽（去除Ca2+ , Mg2+）加葡萄糖配制成PBS緩沖液，保持一定的滲透壓和pH值。
（2）基礎培養基（MEM）：主要為多種氨基酸，加入葡萄糖，雙蒸餾水溶解。
（3）接種培養液：用于胰酶消化后的細胞分散，做成細胞懸液，其成分為MEM含1%谷氨酰胺，另加入10%馬血清，當天配制。
（4）維持培養液：接種后24h，全部換成此液，后每2周換一次，每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清，1%谷氨酰胺，及適量的支持性營(yíng)養物質(zhì)。
2、培養基質(zhì) 常用鼠尾膠、小牛皮膠，多聚賴(lài)氨酸，再涂膠
3、消毒培養皿的備用。所有培養器皿均需清水沖洗2-3d，達兩次ddH2O，每遍洗刷3-4次，加塞包裝，置于烤箱中干燥消毒，于培養前1天進(jìn)行。
神經(jīng)細胞分散培養
（一）選材 常用胚胎動(dòng)物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d，新生鼠或胎鼠（12-14d）或人胚胎。不過(guò)也有認為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以19d為宜，小鼠 以18d為宜，大鼠紋狀體以10d為宜；若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養的大鼠胚，則黑質(zhì)以13d，紋狀體18-21d為宜；小腦以20-21d小鼠胚胎，所獲蒲 氏細胞成活率高，顆粒細胞正在分化；脊髓與DRG聯(lián)合培養，常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎，取材易，神經(jīng)成活率高。
（二）取材。腦則取出相應組織，在解剖液中先剪碎，以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上，用小刀將其要成背腹兩側，分別培養。
（三）細胞分離與接種。神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min，移入接種液，停止消化，并洗去胰蛋白酶液，用細口吸管吹打細胞懸液，使其充分分散，如此多次，待沉淀后吸出上層細胞懸液，計數，預置細胞密度，接種于培養皿（1×106），做電生理應為5×105或更低。
（四）抑制膠質(zhì)細胞生長(cháng)。培養3-5d后，也有人認為培養7d后，用阿糖胞苷，或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細胞的生長(cháng)。
（五）觀(guān)察。接種6-12h，開(kāi)始貼壁，并有集合現象，細胞生長(cháng)突起明顯，5-7d膠質(zhì)細胞增生明顯，7-10d膠質(zhì)細胞成片于神經(jīng)細胞下面，形成 地毯，2周時(shí)神經(jīng)細胞生長(cháng)最豐滿(mǎn)，四周暈光明顯，一個(gè)月后，有些神經(jīng)細胞開(kāi)始退化，變形，甚至出現空泡，一般培養2-4周最宜。
但神經(jīng)細胞只能增大，而不能增殖，只能原代，不能傳代，不會(huì )有細胞周期，而且隨培養時(shí)間的延長(cháng)，細胞數量在下降，但膠質(zhì)細胞可以，神經(jīng)膠質(zhì)細胞也可 以。在培養過(guò)程中，早期9-12d時(shí)，有較多的神經(jīng)細胞死亡，這是第一次死亡階段，應注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細胞一般突起長(cháng)而多，且相互 形成突觸。
（六）常用培養細胞實(shí)驗有：FCM的蛋白總量分析；膜片鉗與離子通道的分析；免疫組化分析；
但免疫組化分析應注意，由于抗體直接作用于活細胞，不易穿透活細胞，故對核內抗原定位時(shí)，首先考慮膜對抗體的通透性問(wèn)題。常用化學(xué)試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。
在免疫組化中，或其它組織學(xué)染色中，常用不同的染色方法以區分不同細胞，如半乳糖腦苷脂對小樹(shù)突膠質(zhì)細胞標記明顯；GFAP對星形膠質(zhì)細胞具有特異 性染色等。這對研究神經(jīng)系統中膠質(zhì)細胞功能具有極大的應用價(jià)值。神經(jīng)膠質(zhì)細胞以往多被忽視，其在腦血管疾?。ㄈ缛毖該p傷）、退行性疾?。ㄈ鏏D、 PD）、損傷后膠質(zhì)細胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經(jīng)細胞功能和營(yíng)養支持的物質(zhì)基礎。
第四節 肌組織細胞培養
各種肌組織均可用于培養，以心肌和骨骼肌較實(shí)用。
（一）骨骼肌細胞培養
1、出生1一2天的乳鼠，引頸處死。
2、無(wú)菌取大腿肌組織，切成0.3一0.5cm2小塊后，用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化，無(wú)菌紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)。
3、計數調整細胞密度。
4、快接種量2×106/皿入培養基培養。
5、培養基內含10%小牛血清，可加1%的胎汁以促進(jìn)分化。
接種在膠原或膠原的底物上能促進(jìn)細胞分化，明膠配置：用Hanks液配成0.01%明膠。
該細胞接種率約50%，細胞生長(cháng)開(kāi)始呈紡錘形，培養50－52小時(shí)后出現融合形成肌細胞狀多核纖維。數日后融合停止，此時(shí)可觀(guān)察到橫紋，一般在融合后二、三天內能見(jiàn)到收縮現象。
（二）心肌細胞培養
心肌細胞是最早的培養材料，Carrel曾長(cháng)期培養過(guò)心肌組織，至今心肌仍不失為好的培養物，最常用的是雞胚心肌。
心肌比較容易培養和生長(cháng)，可用懸滴培養、組織塊培養和消化培養法，均可獲良好的效果。取心室肌培養較好，原代培養的雞胚心肌呈紡錘形，培養成功時(shí)，一周后可見(jiàn)節律性收縮現象。
第五節 巨噬細胞培養
巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對象。巨噬細胞容易獲得，便于培養，并可進(jìn)行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件適宜下可生活2－3周，多用做原代培養，難以長(cháng)期生存。
巨噬細胞也建有無(wú)限細胞系，大多來(lái)自小鼠，如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養中呈巨噬細胞形態(tài)和吞噬功能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。
培養巨噬細胞可用各樣方法和各種來(lái)源來(lái)獲取細胞，以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用，其法如下：
1、實(shí)驗前三天，向小鼠腹腔內注入無(wú)菌硫羥乙酸肉湯lml（勿注入腸內?。?，以刺流產(chǎn)生大量的巨噬細胞。
2、引頸處死小鼠。
3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3－5秒。
4、置動(dòng)物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開(kāi)腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側，暴露出腹膜壁。
5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同時(shí)用手指從兩側壓揉腹膜壁，使液體在腹腔內流動(dòng)。
6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側．使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內。
7、小心拔出針頭，把液體注入離心管。
8、4℃下250g離心10分鐘后，去上清，加10ml Eagle培養基。
9、計數細胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細胞，其中90%為巨噬細胞。
10、以3×105個(gè)貼附細胞/平方厘米接種。
11、接種數小時(shí)后，除去培養液，可去除其它白細胞，純化培養細胞，用Eagle液沖洗1一2次，再加新Eagle培養液置CO2溫箱中。
第六節 腎小球分離、移植培養
SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡1～2分鐘，2次，置超凈臺內，打開(kāi)腹腔取出腎臟剪碎，置含Hank's液的無(wú)菌培養皿洗滌，置80目不銹 鋼篩網(wǎng)上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過(guò)篩網(wǎng)，濾過(guò)組織Hank's液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網(wǎng)，濾過(guò)，去小組織塊，濾過(guò)物吸至 200目不銹鋼篩網(wǎng)，輕輕濾過(guò)，Hank's液洗滌1次，收集網(wǎng)上腎小球，鏡下觀(guān)察為分離良好的腎小球。
腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37℃消化20分鐘，加血清終止胰酶反應，離心除去膠原酶。處理過(guò)的腎小球計數后接種至24孔培養板或25ml培養瓶，使腎小球大于60個(gè)/cm2， 加培養基5～10ml（培養基組成：F12—3T3上清1：1；5%馬血清；2.5%胎牛血清；胰島素5μg/ml；25ng/ml氫化可的松；5μg /ml轉鐵蛋白；25ng/ml前列腺素E1；甲狀腺素0.02ng/ml；D-纈氨酸150ng/ml）腎小球培養8～10天，去除腎小球未生長(cháng)組分， 細胞繼續培養24小時(shí)，形態(tài)學(xué)觀(guān)察：細胞生長(cháng)成單層多角型細胞，直徑約100μm。
第七節 裸小鼠移植瘤單細胞分離培養
無(wú)菌條件下取出小鼠移植瘤組織，剪成1mm3小塊，用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時(shí)，再加等體積0.2%胰酶消化5～8分鐘，在消化過(guò)程 中用吸管吹打組織塊或用自制裝置（分別作為加樣和收集器的兩個(gè)注射器中間加一小濾器連接而成，濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細胞）來(lái)回推動(dòng)注射 器吹打組織以分離單細胞，終止酶消化方法同上。
常規方法接種培養收獲細胞。
第六章 腫瘤細胞的培養
腫瘤細胞在組織培養中占有核心的位置，首先癌細胞是比較容易培養的細胞。當前建立的細胞系中癌細胞系是最多的。另外腫瘤對人類(lèi)是威脅最大的疾病。腫瘤細胞培養是研究癌變機理、抗癌藥檢測、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細胞培養對闡明和解決癌癥將起著(zhù)不可估量的作用。
第一節 組織培養腫瘤細胞生物學(xué)特性
腫瘤細胞與體內正常細胞相比，不論在體內或在體外，在形態(tài)、生長(cháng)增值、遺傳性狀等方面都有顯著(zhù)的不同。生長(cháng)在體內的腫瘤細胞和在體外培養的腫瘤細胞，其差異較小，但也并非完全相同。培養中的腫瘤細胞具以下突出特點(diǎn)：
（一）形態(tài)和性狀
培養中癌細胞無(wú)光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài)，大多數腫瘤細胞鏡下觀(guān)察比二倍體細胞清晰，核膜、核仁輪廓明顯，核糖體顆粒豐富。電鏡觀(guān)察癌細胞表面的微絨毛多而細密，微絲走行不如正常細胞規則，可能與腫瘤細胞具有不定向運動(dòng)和錨著(zhù)不依賴(lài)性有關(guān)。
（二）生長(cháng)增殖
腫瘤細胞在體內具有不受控增殖性，在體外培養中仍如此。正常二倍體細胞在體外培養中不加血清不能增殖，是因血清中含有很細胞增殖生長(cháng)的因子，而癌細 胞在低血清中（2％～5％）仍能生長(cháng)。已證明腫瘤細胞有自泌或內泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細胞發(fā)生轉化后，出現能在低血清培養基中生長(cháng)的現象，已成為 檢測細胞惡變的一個(gè)指標。癌細胞或培養中發(fā)生惡性轉化后的單個(gè)細胞培養時(shí)，形成集落（克?。┑哪芰Ρ日＜毎麖?。另外癌細胞增殖數量增多擴展時(shí)，接觸抑制 消除，細胞能相互重疊向三維空間發(fā)展，形成堆積物。
（三）永生性
永生性也稱(chēng)不死性。在體外培養中表現為細胞可無(wú)限傳代而不凋亡（Apoptosis）。體外培養中的腫瘤細胞系或細胞株都表現有這種性狀，體內腫瘤 細胞是否如此尚無(wú)直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡，從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細胞的永生性是否能反證它在體內時(shí)同樣如此？也尚難 肯定。從近年建立細胞系或株的過(guò)程說(shuō)明，如果永生性是體內腫瘤細胞所固有的，腫瘤細胞應易于培養。事實(shí)上，多數腫瘤細胞初代培養時(shí)并不那么容易。生長(cháng)增殖 并不旺盛；經(jīng)過(guò)純化成單一化瘤細胞后，也大多增殖若干代后，便出現類(lèi)似二倍體細胞培養中的停滯期。過(guò)此階段后才獲得永生性，順利傳代生長(cháng)下去。從而說(shuō)明體 外腫瘤細胞的永生性有可能是體外培養后獲得的。從一些具有永生性而無(wú)惡性性的細胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等細胞證明，永生性和惡性 （包括浸潤性）是兩種性狀，受不同基因調控，但卻有相關(guān)性?？赡苡郎允羌毎麗鹤兊碾A段。至少在體外是如此。
（四）浸潤性
浸潤性是腫瘤細胞擴張性增殖行為，培養癌細胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養時(shí)，能浸潤入其它組織細胞中，并有穿透人工隔膜生長(cháng)的能力。
（五）異質(zhì)性
所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細胞組成。異質(zhì)性構成同一腫瘤內細胞的活力有差別的瘤組織；處于瘤體周邊區的細胞獲 得血液供應多，增殖旺盛，中心區有的細胞衰老退化，有的處于周期阻滯狀態(tài)，那些呈活躍增殖狀態(tài)的細胞稱(chēng)干細胞（Stem Cells）、只有這些干細胞才是支持腫瘤生長(cháng)的成分。腫瘤干細胞培養時(shí)易于生長(cháng)增殖；把干細胞分離出來(lái)的培養方法稱(chēng)干細胞培養。
（六）細胞遺傳
大多數腫瘤細胞有遺傳學(xué)改變，如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細胞群常由多個(gè)細胞群組成，有干細胞系和數個(gè)亞系，并不斷進(jìn)行著(zhù)適應性演變。
（七）其它
腫瘤細胞在體外不易生長(cháng)的原因可能由于：
①依賴(lài)性：腫瘤細胞雖有較強克隆生長(cháng)力，但仍有一定的群體性或與其它細胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細胞與腫瘤細胞的相互依存，二是腫瘤細胞與基質(zhì)成纖維細胞的依賴(lài)。體外分散培養和排除成纖維細胞后也會(huì )同時(shí)消除或減弱這些依存關(guān)系，可能影響癌細胞增殖生長(cháng)的活性；
②腫瘤細胞的自泌也會(huì )因分散培養而被稀釋?zhuān)_不到腫瘤生長(cháng)的需求，降低腫瘤細胞的生長(cháng)增殖力；
③并非所有腫瘤細胞都有強的生長(cháng)活力和長(cháng)的Life Span，只有干細胞才有強的增殖生長(cháng)能力，但這些細胞數量很少；
④離體培養腫瘤細胞可能需求與體內相似的特殊生存條件。
有細胞增殖，傳若干代后停止生長(cháng)或衰退死亡；
傳數代后細胞增殖緩慢，經(jīng)過(guò)一段停滯期后，才又呈旺盛生長(cháng)狀態(tài)，形成穩定生長(cháng)的腫瘤傳代細胞系。
以上現象說(shuō)明腫瘤細胞對體外生存條件有較高的要求，并需經(jīng)過(guò)對新環(huán)境的適應才能生長(cháng)，因此欲獲得好的培養效果，不能局限于一般培養法，必須采用一些特殊的措施。
1、適宜底物：把經(jīng)過(guò)純化的細胞接種在不同的底物上，如鼠尾膠原底層、飼細胞層等。
2、生長(cháng)因子：應用促細胞生長(cháng)因子，向培養液中增加一種或幾種促細胞生長(cháng)因子。根據細胞種類(lèi)不同選用不同的促生長(cháng)物，常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長(cháng)因子。
為提高腫瘤細胞對體外培養環(huán)境的適應力和增加有活力癌細胞（干細胞）的數量，可采用動(dòng)物體轉嫁接種成瘤后，再從動(dòng)物體內取出進(jìn)行培養，能提高體外培養的成功率。受體動(dòng)物以裸鼠最好。
3、動(dòng)物體媒介培養方法：
（1）瘤塊接種：取新鮮瘤組織，用Hanks液洗凈血污，切成1～3毫米小塊，用穿刺針頭吸一小瘤塊，用酒精棉球擦拭動(dòng)物腹部后，直接刺入皮下，注入瘤塊；
（2）飼養觀(guān)察，待腫瘤生長(cháng)達較大體積后，剝取出瘤組織；
（3）進(jìn)行體外培養。
（4）為防止失敗，仍取部分瘤組織繼續在裸鼠體內傳代。通過(guò)裸鼠媒介接種，有活力的腫瘤細胞數量增多，細胞培養易于成功。
腫瘤細胞培養方法與培養正常細胞完全相同，但成功率比正常細胞高。
第二節 培養方法
腫瘤細胞培養成功關(guān)鍵在于：取材、成纖維細胞的排除、選用適宜的培養液和培養底物等幾個(gè)方面。在具體培養方法方面，腫瘤細胞培養與正常組織細胞培養并無(wú)原則差別，初代培養應用組織塊和消化培養法均可。
1、取材：
人腫瘤細胞來(lái)自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要，體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區，取材時(shí)盡量避免用退變組織，要挑選活力較好的部位。癌性轉移淋巴結或胸腹水是好的培養材料。取材后宜盡快進(jìn)行培養，如因故不能立即培養，可貯存于4℃中，但不宜栽過(guò)24小時(shí)。
2、培養基：
腫瘤細胞對培養基的要求不如正常細胞嚴格，一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培養基等皆可用于腫瘤細胞培養。腫瘤細胞對血清的需求比正常細胞低，正常細胞培養不加血清不能生長(cháng)，腫瘤細胞在低血清培養基 中也能生長(cháng)。腫瘤細胞對培養環(huán)境適應性較大，是因腫瘤細胞有自泌（Autocrine）性產(chǎn)生促生長(cháng)物質(zhì)之故。但這并不說(shuō)明腫瘤細胞完全不需要這些成分。 按不同細胞需要不同的生長(cháng)因子；腫瘤細胞與正常細胞之間、腫瘤細胞與腫瘤細胞之間對生長(cháng)因子的需求都存在著(zhù)差異。但大多數腫瘤細胞培養中仍需要生長(cháng)因子。 有的還需特異性生長(cháng)因子〔如乳腺癌細胞等）?？傊囵B腫瘤細胞仍需加血清和相關(guān)生長(cháng)因子培養更易成功。
3、成纖維細胞的排除：
成纖維細胞常與腫瘤細胞同時(shí)混雜生長(cháng)，致難以純化腫瘤細胞。而且成纖維細胞常比腫瘤細胞生長(cháng)得快，最終能壓制腫瘤細胞的生長(cháng)。因此排除成纖維細胞成為腫瘤細胞培養中的關(guān)鍵。排除成纖維細胞有多種方法（表2－1）。
表2－1 抑制成纖維細胞生長(cháng)因素
表2－1 抑制成纖維細胞生長(cháng)因素
注：上表結果為個(gè)別實(shí)驗室經(jīng)驗，僅供參考
第三節 成纖維細胞排除法
1、機械刮除法：
是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭（用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲）、或裹少許脫脂棉制成，裝入試管中高壓滅菌后備用（也可用特制電熱燒灼器刮除）。刮除程序為：
（1）標記：鏡下觀(guān)察，用不脫色筆在培養瓶皿的背面圈下生長(cháng)腫瘤細胞的部位；
（2）刮除：棄掉培養液，把無(wú)菌膠刮伸入瓶皿中，肉眼或顯微鏡窺視下，刮除無(wú)標記空間；
（3）用Hanks液沖洗一兩次，洗除被刮掉的細胞；
（4）注入培養液繼續培養，如發(fā)現仍有成纖維細胞殘留，可重復刮除至完全除掉為止
2、反復貼壁法：
根據腫瘤細胞比成纖維細胞貼壁速度慢的特點(diǎn)，并結合使用不加血清的營(yíng)養液，把含有兩類(lèi)細胞的細胞懸液反復貼壁，使兩類(lèi)細胞相互分離，操作方法與傳代相同。
（1）待細胞生長(cháng)達一定數量后，倒出舊培養液，用胰酶消化后，Hanks 沖洗2次，加入不含血清的培養液，吹打制成細胞懸液；
（2）取編號為此A、B、C三個(gè)培養瓶；首先把懸液接種入A培養瓶中。置溫箱中靜止培養5～20分鐘后，輕輕傾斜培養瓶，讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養液，再接種入B培養瓶中后；向A瓶中補充少許完全培養液置溫箱中繼續培養；
（3）培養B瓶中細胞5～20分鐘后，接處理A的方法，把培養液注入C培養瓶中；再向B瓶中補加完全培養基。
當三個(gè)瓶?jì)榷己信囵B液后，均在溫箱中繼續培養。如操作成功，次日觀(guān)察可見(jiàn)A瓶主要為成纖維細胞，B瓶?jì)深?lèi)細胞相雜，C瓶可能主要為癌細胞。必要時(shí)可反復處理多次，直至癌細胞純化為止。
3、消化排除法：
此法曾用于乳癌細胞的培養，具體程序是：
（1）先是用0.5%胰蛋白酶和0.02％EDTA（1：1）混合液漂洗培養細胞一次，然后再換成新的混合液繼續消化，并在倒置顯微鏡下窺視和不時(shí)搖動(dòng)培養瓶，到半數細胞脫落下來(lái)后，便立即停止消化；
（2）把消化液吸入離心管中，離心去上清，吸入另瓶中，加培養液置溫箱中培養；向原瓶?jì)纫惭a加新的培養液繼續培養。用此法處理后，成纖維細胞比腫瘤細胞易先脫落。經(jīng)過(guò)幾次反復處理，可能把成纖維細胞除凈。
4、膠原酶消化法：
本法是利用成纖維細胞對膠原酶較為敏感的特點(diǎn)，通過(guò)消化進(jìn)行選擇。
（1）可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理，邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視，當發(fā)現成纖維細胞被除掉后，即終止消化；
（2）用Hanks洗滌處理一次后，更換新培養液，繼續培養，可獲純凈腫瘤細胞。如成纖維細胞未被除凈，可再次重復。
5、其它方法：
有人發(fā)現聚丙烯酰胺有抑制成纖維細胞生長(cháng)的作用；也有人用聚蔗糖制備成比重1.025～1.085的密度梯度離心液，加入細胞懸液后，在23℃中 800g離心 10分種。在比重1.025～1.050層為成纖維細胞，在比重1.050～1.085層為上皮細胞，再經(jīng)過(guò)分離進(jìn)行培養。最近也有人應用特殊化學(xué)物如 SOD抑制成纖維細胞生長(cháng)的方法。
選用上述任何一種方法，都需進(jìn)行試驗，取得必要經(jīng)驗，找出適合的條件，才能獲得好的效果。
第四節 提高腫瘤細胞培養存活率和生長(cháng)率措施
根據人們的經(jīng)驗，腫瘤細胞在體外不易培養，建立能傳代的腫瘤細胞系更為困難。當腫瘤組織或細胞初代接種培養后，常出現以下幾種情況：
完全無(wú)細胞游出或移動(dòng)；
有細胞移動(dòng)和游出，但無(wú)細胞增殖，細胞長(cháng)時(shí)間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代；
第五節 體外培養腫瘤細胞生物學(xué)檢測
一旦培養的腫瘤細胞生長(cháng)成形態(tài)上單一的細胞群體或細胞系（或株）后，不論用于實(shí)驗研究還是建立細胞系，都需要做一系列的細胞生物學(xué)測定，主要的目的在于求得證明：
所培養的細胞系的確來(lái)源于原體內具有惡性的細胞，而非正常細胞或其它細胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學(xué)性狀。測定項目數量無(wú)明確規定，根據需要而定，以下為常做的項目和要點(diǎn)。
【形態(tài)觀(guān)察】主要觀(guān)察細胞的一般形態(tài)，如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。
【細胞生長(cháng)增殖】檢測細胞生長(cháng)曲線(xiàn)、細胞分裂指數、倍增時(shí)間、細胞周期時(shí)間。
【細胞核型分析】檢測核型特點(diǎn)，染色體數量、標記染色體的有無(wú)、帶型等。
【凝集試驗】檢測凝集力。
【軟瓊脂培養】檢測集落形成能力。
【異體動(dòng)物接種】向異體動(dòng)物體內（皮下）接種細胞懸液，觀(guān)察成瘤能力。
【其它】除上述項目外，根據需要還可做同位素標記、組織化學(xué)成分分析，熒光顯微鏡觀(guān)察等。
在上述腫瘤細胞生物學(xué)檢測中，最主要的為：異體動(dòng)物（以用裸鼠為上）接種成瘤、軟瓊脂培養、核型分析、細胞骨架和電鏡觀(guān)察等幾項。當然從分子細胞學(xué)角度考慮尚應做癌基因和抗癌基因等的檢測，這些項目將在本書(shū)第二篇中介紹。
第六節 對腫瘤細胞系或細胞株的評價(jià)
已建成的各種腫瘤細胞系或細胞株，無(wú)疑都是可用的實(shí)驗對象。近年我國已建成的腫瘤細胞系已非常多，并獲得越來(lái)越廣泛的應用。但根據研究者的經(jīng)驗，在 使用這些細胞系時(shí)，應持特別審慎態(tài)度，主要是應考慮到這些細胞在長(cháng)期傳代中有否發(fā)生遺傳性改變的可能。眾所周知，長(cháng)期傳代細胞系染色體核型常是不穩定的。 另外也可能發(fā)生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結果可能導致細胞產(chǎn)生生物學(xué)性狀上的變動(dòng)。以近年建成的各種腫瘤細胞系為例，都已傳代少則幾十，多則 百代以上后，才確認建成了細胞系。這種情況下很難保證細胞從初代到建成時(shí)的性狀仍是一致的。
已如前述，癌細胞在培養中并非能很順利地傳下去，凡已長(cháng)期傳代的細胞系，都已獲得不死性。當前尚未完全確證所有癌細胞都具有不死性；因此尚難肯定在 長(cháng)期培養中的癌細胞的生物學(xué)性狀與體內時(shí)仍完全相同（包括不死性）。據上述對用癌細胞系所獲實(shí)驗結果應盡量做分析性的結論，避免做概括性的與體內等同的結 論，外推與體內等同更是不妥的。廣泛來(lái)說(shuō)，應用各種較長(cháng)時(shí)間培養細胞做實(shí)驗時(shí)，都應如此。
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