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細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)技術(shù)匯總(四) 二維碼
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2016-11-18 細(xì)胞之邦 溫馨提示:文章結(jié)尾贈(zèng)送《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)指南》電子書哦! 目錄:
第五章 常見(jiàn)組織細(xì)胞的培養(yǎng)方法 含 第一節(jié) 上皮細(xì)胞培養(yǎng) 第二節(jié) 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 第三節(jié) 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) 第四節(jié) 肌組織細(xì)胞培養(yǎng) 第五節(jié) 巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 第六節(jié) 腎小球分離、移植培養(yǎng) 第七節(jié) 裸小鼠移植瘤單細(xì)胞分離培養(yǎng) 第六章 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 含 第一節(jié) 組織培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性 第二節(jié) 培養(yǎng)方法 第三節(jié) 成纖維細(xì)胞排除法 第四節(jié) 提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長(zhǎng)率措施 第五節(jié) 體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè) 第六節(jié) 對(duì)腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株的評(píng)價(jià) 第五章 常見(jiàn)組織細(xì)胞的培養(yǎng)方法 體內(nèi)組織細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí),所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似,但由于物種、個(gè)體遺傳背景及所處發(fā)育階段等的不同,各自要求條件有一定差別,所采取的培養(yǎng)技術(shù)措施亦不盡相同,現(xiàn)介紹個(gè)別組織細(xì)胞培養(yǎng)的要點(diǎn)如下: 第一節(jié) 上皮細(xì)胞培養(yǎng) 上皮細(xì)胞包括腺上皮是很多器官如肝、胰、乳腺等的功能成分,又由于癌起源于上皮組織,故上皮細(xì)胞培養(yǎng)特別受到重視。但上皮細(xì)胞培養(yǎng)中?;祀s有成纖維細(xì)胞,培養(yǎng)時(shí)生長(zhǎng)速度往往超過(guò)上皮細(xì)胞,并難以純化,同時(shí)上皮細(xì)胞難以在體外長(zhǎng)期生存,因此純化和延長(zhǎng)生存時(shí)間是培養(yǎng)關(guān)鍵。 體內(nèi)上皮細(xì)胞生長(zhǎng)在膠原構(gòu)成的基膜,因此培養(yǎng)在有膠原的底物上可能利于生長(zhǎng),另外人或小鼠表皮細(xì)胞培養(yǎng)在以3T3細(xì)胞為飼養(yǎng)層(用射線照射后)時(shí),細(xì)胞易生長(zhǎng)并可發(fā)生一定程度的分化現(xiàn)象。降低PH、Ca2+含量和溫度,向培養(yǎng)基中加入表皮生長(zhǎng)因子,均有利于表皮細(xì)胞生長(zhǎng)。 以表皮細(xì)胞為例,用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮細(xì)胞,其法如下(黑木凳志夫 1981) 1、取材:外科植皮或手術(shù)殘余皮膚小塊,早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好,取角化層薄者,切成0.5-1平方厘米小塊。 2、置0.02%EDTA中,室溫,5分鐘。 3、換入0.25%胰蛋白酶中,4℃過(guò)夜。 4、分離:取出皮塊,用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開(kāi)。 5、取出表皮,剪成更小的塊后,置0.25%胰酶中,37℃,30—60分鐘。 6、反復(fù)吹打,制成懸液。 7、培養(yǎng):用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過(guò)后,低速離心,吸去上清。 8、直接加入培養(yǎng)基(Eagle加20%小牛血清)制成細(xì)胞懸液,接種入培養(yǎng)瓶,CO2溫箱培養(yǎng)。 第二節(jié) 內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng) 內(nèi)皮細(xì)胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細(xì)胞,對(duì)于研究?jī)?nèi)皮細(xì)胞再生、腫瘤促血管生長(zhǎng)因子(TAF)等有很大價(jià)值。 研究人內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡(jiǎn)便,其法如下: 1、產(chǎn)后新鮮臍帶,無(wú)菌剪取10—15厘米長(zhǎng)一段,如不能立即培養(yǎng),可于12小時(shí)內(nèi)保存于4℃。 2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血,在入口處用線繩扎緊,以防液體返流。 3、用血管鉗夾緊臍帶一端,從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%的粗制膠原酶,充滿血管,消化3—10分鐘;注入口用線繩扎,以防液體返流。 4、吸出含有內(nèi)皮細(xì)胞的消化液,于離心管中,注入溫PBS輕輕反復(fù)沖洗后,一并注入離心管中(此步驟可重復(fù))。 5、離心去上清,加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液,接種入培養(yǎng)器皿中,置溫箱培養(yǎng)。兩至三天可見(jiàn)細(xì)胞長(zhǎng)成單層。 第三節(jié) 神經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng) 神經(jīng)細(xì)胞(神經(jīng)元)不易培養(yǎng),只有在適宜情況下,如接種在膠原底層上,或加入神經(jīng)生長(zhǎng)因子和膠質(zhì)細(xì)胞因子時(shí),可出現(xiàn)一定程度的分化,長(zhǎng)出突起等現(xiàn)象,但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)的成分。 人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng),不僅能獲得生長(zhǎng)的膠質(zhì)細(xì)胞,也可形成能傳代的二倍體細(xì)胞系。一般說(shuō)來(lái),膠質(zhì)細(xì)胞在培養(yǎng)中生長(zhǎng)不穩(wěn)定,不易自發(fā)轉(zhuǎn)化,但對(duì)外界因素仍保持很好的敏感性,可用ROUS病毒和SV4等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。 一、設(shè)備: 無(wú)菌操作設(shè)備。 二、大型設(shè)備CO2 培養(yǎng)箱:恒溫5%、10%CO2維持培養(yǎng)液中pH值。 倒置顯微鏡:用于每天觀察貼壁細(xì)胞生長(zhǎng)情況。 解剖顯微鏡,用于準(zhǔn)確地取材。 常溫冰箱:-4℃,用于保存各種培養(yǎng)液,解剖液和鼠尾膠。 低溫冰箱:-20℃--80℃,用于儲(chǔ)存血清酶,貴重物品和試劑。 電熱干烤箱:用于消毒玻璃器皿。 高壓消毒鍋:用于消毒培養(yǎng)皿,手術(shù)器械。 過(guò)濾器:配制解剖液、培養(yǎng)液,必須過(guò)濾后才可使用,以去除細(xì)菌。 滲透壓儀,pH劑,天平等。 三、培養(yǎng)器皿及手術(shù)器械 1、培養(yǎng)皿:常用35mm塑料及玻璃皿,解剖取材用15mm-90mm直徑。 2、培養(yǎng)板,24-40孔,可用于開(kāi)放培養(yǎng)。 3、培養(yǎng)瓶: 4、吸管,常用1,5,10ml,均需泡酸、洗滌、滅菌后方可使用。 5、各類培養(yǎng)液貯存器。 6、小型手術(shù)器械。 準(zhǔn)備: 1、配制培養(yǎng)液 (1)解剖液:以無(wú)機(jī)鹽(去除Ca2+ , Mg2+)加葡萄糖配制成PBS緩沖液,保持一定的滲透壓和pH值。 (2)基礎(chǔ)培養(yǎng)基(MEM):主要為多種氨基酸,加入葡萄糖,雙蒸餾水溶解。 (3)接種培養(yǎng)液:用于胰酶消化后的細(xì)胞分散,做成細(xì)胞懸液,其成分為MEM含1%谷氨酰胺,另加入10%馬血清,當(dāng)天配制。 (4)維持培養(yǎng)液:接種后24h,全部換成此液,后每2周換一次,每次換1/2。其成分為MEM中含5%馬血清,1%谷氨酰胺,及適量的支持性營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。 2、培養(yǎng)基質(zhì) 常用鼠尾膠、小牛皮膠,多聚賴氨酸,再涂膠 3、消毒培養(yǎng)皿的備用。所有培養(yǎng)器皿均需清水沖洗2-3d,達(dá)兩次ddH2O,每遍洗刷3-4次,加塞包裝,置于烤箱中干燥消毒,于培養(yǎng)前1天進(jìn)行。 神經(jīng)細(xì)胞分散培養(yǎng) (一)選材 常用胚胎動(dòng)物或新生鼠神經(jīng)組織。雞胚常用胚齡6-8d,新生鼠或胎鼠(12-14d)或人胚胎。不過(guò)也有認(rèn)為與組織相關(guān)。如大白鼠胚胎以19d為宜,小鼠 以18d為宜,大鼠紋狀體以10d為宜;若紋狀體與黑質(zhì)聯(lián)合培養(yǎng)的大鼠胚,則黑質(zhì)以13d,紋狀體18-21d為宜;小腦以20-21d小鼠胚胎,所獲蒲 氏細(xì)胞成活率高,顆粒細(xì)胞正在分化;脊髓與DRG聯(lián)合培養(yǎng),常用4-7d雞胚或12-14d小鼠胚胎,取材易,神經(jīng)成活率高。 (二)取材。腦則取出相應(yīng)組織,在解剖液中先剪碎,以使胰酶消化。脊髓則固定于瓊脂板上,用小刀將其要成背腹兩側(cè),分別培養(yǎng)。 (三)細(xì)胞分離與接種。神經(jīng)組織用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min,移入接種液,停止消化,并洗去胰蛋白酶液,用細(xì)口吸管吹打細(xì)胞懸液,使其充分分散,如此多次,待沉淀后吸出上層細(xì)胞懸液,計(jì)數(shù),預(yù)置細(xì)胞密度,接種于培養(yǎng)皿(1×106),做電生理應(yīng)為5×105或更低。 (四)抑制膠質(zhì)細(xì)胞生長(zhǎng)。培養(yǎng)3-5d后,也有人認(rèn)為培養(yǎng)7d后,用阿糖胞苷,或5-FU抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。 (五)觀察。接種6-12h,開(kāi)始貼壁,并有集合現(xiàn)象,細(xì)胞生長(zhǎng)突起明顯,5-7d膠質(zhì)細(xì)胞增生明顯,7-10d膠質(zhì)細(xì)胞成片于神經(jīng)細(xì)胞下面,形成 地毯,2周時(shí)神經(jīng)細(xì)胞生長(zhǎng)最豐滿,四周暈光明顯,一個(gè)月后,有些神經(jīng)細(xì)胞開(kāi)始退化,變形,甚至出現(xiàn)空泡,一般培養(yǎng)2-4周最宜。 但神經(jīng)細(xì)胞只能增大,而不能增殖,只能原代,不能傳代,不會(huì)有細(xì)胞周期,而且隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞數(shù)量在下降,但膠質(zhì)細(xì)胞可以,神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也可 以。在培養(yǎng)過(guò)程中,早期9-12d時(shí),有較多的神經(jīng)細(xì)胞死亡,這是第一次死亡階段,應(yīng)注意保持條件的恒定。在此之后存活下去的細(xì)胞一般突起長(zhǎng)而多,且相互 形成突觸。 (六)常用培養(yǎng)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)有:FCM的蛋白總量分析;膜片鉗與離子通道的分析;免疫組化分析; 但免疫組化分析應(yīng)注意,由于抗體直接作用于活細(xì)胞,不易穿透活細(xì)胞,故對(duì)核內(nèi)抗原定位時(shí),首先考慮膜對(duì)抗體的通透性問(wèn)題。常用化學(xué)試劑以增加其通透性或采用冰凍方法解決。 在免疫組化中,或其它組織學(xué)染色中,常用不同的染色方法以區(qū)分不同細(xì)胞,如半乳糖腦苷脂對(duì)小樹(shù)突膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記明顯;GFAP對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞具有特異 性染色等。這對(duì)研究神經(jīng)系統(tǒng)中膠質(zhì)細(xì)胞功能具有極大的應(yīng)用價(jià)值。神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞以往多被忽視,其在腦血管疾病(如缺血性損傷)、退行性疾病(如AD、 PD)、損傷后膠質(zhì)細(xì)胞的填充等具有不可忽視的作用。它也是神經(jīng)細(xì)胞功能和營(yíng)養(yǎng)支持的物質(zhì)基礎(chǔ)。 第四節(jié) 肌組織細(xì)胞培養(yǎng) 各種肌組織均可用于培養(yǎng),以心肌和骨骼肌較實(shí)用。 (一)骨骼肌細(xì)胞培養(yǎng) 1、出生1一2天的乳鼠,引頸處死。 2、無(wú)菌取大腿肌組織,切成0.3一0.5cm2小塊后,用不含鈣鎂離子的Hanks液配的0.25%胰蛋白酶消化,無(wú)菌紗網(wǎng)或紗布濾過(guò)。 3、計(jì)數(shù)調(diào)整細(xì)胞密度。 4、快接種量2×106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。 5、培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清,可加1%的胎汁以促進(jìn)分化。 接種在膠原或膠原的底物上能促進(jìn)細(xì)胞分化,明膠配置:用Hanks液配成0.01%明膠。 該細(xì)胞接種率約50%,細(xì)胞生長(zhǎng)開(kāi)始呈紡錘形,培養(yǎng)50-52小時(shí)后出現(xiàn)融合形成肌細(xì)胞狀多核纖維。數(shù)日后融合停止,此時(shí)可觀察到橫紋,一般在融合后二、三天內(nèi)能見(jiàn)到收縮現(xiàn)象。 (二)心肌細(xì)胞培養(yǎng) 心肌細(xì)胞是最早的培養(yǎng)材料,Carrel曾長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)心肌組織,至今心肌仍不失為好的培養(yǎng)物,最常用的是雞胚心肌。 心肌比較容易培養(yǎng)和生長(zhǎng),可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法,均可獲良好的效果。取心室肌培養(yǎng)較好,原代培養(yǎng)的雞胚心肌呈紡錘形,培養(yǎng)成功時(shí),一周后可見(jiàn)節(jié)律性收縮現(xiàn)象。 第五節(jié) 巨噬細(xì)胞培養(yǎng) 巨噬細(xì)胞屬免疫細(xì)胞,有多種功能,是研究細(xì)胞吞噬、細(xì)胞免疫和分子免疫學(xué)的重要對(duì)象。巨噬細(xì)胞容易獲得,便于培養(yǎng),并可進(jìn)行純化。巨噬細(xì)胞屬不繁殖細(xì)胞群,在條件適宜下可生活2-3周,多用做原代培養(yǎng),難以長(zhǎng)期生存。 巨噬細(xì)胞也建有無(wú)限細(xì)胞系,大多來(lái)自小鼠,如P331、S774A.1、RAW309Cr.l等,均獲惡性,培養(yǎng)中呈巨噬細(xì)胞形態(tài)和吞噬功能,易于傳代和瓶壁分離,但難以建株。 培養(yǎng)巨噬細(xì)胞可用各樣方法和各種來(lái)源來(lái)獲取細(xì)胞,以小鼠腹腔取材法最為實(shí)用,其法如下: 1、實(shí)驗(yàn)前三天,向小鼠腹腔內(nèi)注入無(wú)菌硫羥乙酸肉湯lml(勿注入腸內(nèi)?。源塘鳟a(chǎn)生大量的巨噬細(xì)胞。 2、引頸處死小鼠。 3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3-5秒。 4、置動(dòng)物于解剖臺(tái),用針頭固定四肢,持鑷撕開(kāi)腹部皮膚,但勿傷及腹膜壁,把皮膚拉向上下兩側(cè),暴露出腹膜壁。 5、用70%酒精擦洗腹膜壁,注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中,同時(shí)用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁,使液體在腹腔內(nèi)流動(dòng)。 6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè).使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。 7、小心拔出針頭,把液體注入離心管。 8、4℃下250g離心10分鐘后,去上清,加10ml Eagle培養(yǎng)基。 9、計(jì)數(shù)細(xì)胞。每只鼠可產(chǎn)生20一30×106細(xì)胞,其中90%為巨噬細(xì)胞。 10、以3×105個(gè)貼附細(xì)胞/平方厘米接種。 11、接種數(shù)小時(shí)后,除去培養(yǎng)液,可去除其它白細(xì)胞,純化培養(yǎng)細(xì)胞,用Eagle液沖洗1一2次,再加新Eagle培養(yǎng)液置CO2溫箱中。 第六節(jié) 腎小球分離、移植培養(yǎng) SD大鼠頸椎脫臼法處死,75%乙醇浸泡1~2分鐘,2次,置超凈臺(tái)內(nèi),打開(kāi)腹腔取出腎臟剪碎,置含Hank's液的無(wú)菌培養(yǎng)皿洗滌,置80目不銹 鋼篩網(wǎng)上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過(guò)篩網(wǎng),濾過(guò)組織Hank's液混合物用吸管吸至120目不銹鋼篩網(wǎng),濾過(guò),去小組織塊,濾過(guò)物吸至 200目不銹鋼篩網(wǎng),輕輕濾過(guò),Hank's液洗滌1次,收集網(wǎng)上腎小球,鏡下觀察為分離良好的腎小球。 腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶,37℃消化20分鐘,加血清終止胰酶反應(yīng),離心除去膠原酶。處理過(guò)的腎小球計(jì)數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶,使腎小球大于60個(gè)/cm2, 加培養(yǎng)基5~10ml(培養(yǎng)基組成:F12—3T3上清1:1;5%馬血清;2.5%胎牛血清;胰島素5μg/ml;25ng/ml氫化可的松;5μg /ml轉(zhuǎn)鐵蛋白;25ng/ml前列腺素E1;甲狀腺素0.02ng/ml;D-纈氨酸150ng/ml)腎小球培養(yǎng)8~10天,去除腎小球未生長(zhǎng)組分, 細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí),形態(tài)學(xué)觀察:細(xì)胞生長(zhǎng)成單層多角型細(xì)胞,直徑約100μm。 第七節(jié) 裸小鼠移植瘤單細(xì)胞分離培養(yǎng) 無(wú)菌條件下取出小鼠移植瘤組織,剪成1mm3小塊,用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時(shí),再加等體積0.2%胰酶消化5~8分鐘,在消化過(guò)程 中用吸管吹打組織塊或用自制裝置(分別作為加樣和收集器的兩個(gè)注射器中間加一小濾器連接而成,濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細(xì)胞)來(lái)回推動(dòng)注射 器吹打組織以分離單細(xì)胞,終止酶消化方法同上。 常規(guī)方法接種培養(yǎng)收獲細(xì)胞。 第六章 腫瘤細(xì)胞的培養(yǎng) 腫瘤細(xì)胞在組織培養(yǎng)中占有核心的位置,首先癌細(xì)胞是比較容易培養(yǎng)的細(xì)胞。當(dāng)前建立的細(xì)胞系中癌細(xì)胞系是最多的。另外腫瘤對(duì)人類是威脅最大的疾病。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)是研究癌變機(jī)理、抗癌藥檢測(cè)、癌分子生物學(xué)極其重要的手段。腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)闡明和解決癌癥將起著不可估量的作用。 第一節(jié) 組織培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)特性 腫瘤細(xì)胞與體內(nèi)正常細(xì)胞相比,不論在體內(nèi)或在體外,在形態(tài)、生長(zhǎng)增值、遺傳性狀等方面都有顯著的不同。生長(zhǎng)在體內(nèi)的腫瘤細(xì)胞和在體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞,其差異較小,但也并非完全相同。培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞具以下突出特點(diǎn): (一)形態(tài)和性狀 培養(yǎng)中癌細(xì)胞無(wú)光學(xué)顯微鏡下特異形態(tài),大多數(shù)腫瘤細(xì)胞鏡下觀察比二倍體細(xì)胞清晰,核膜、核仁輪廓明顯,核糖體顆粒豐富。電鏡觀察癌細(xì)胞表面的微絨毛多而細(xì)密,微絲走行不如正常細(xì)胞規(guī)則,可能與腫瘤細(xì)胞具有不定向運(yùn)動(dòng)和錨著不依賴性有關(guān)。 (二)生長(zhǎng)增殖 腫瘤細(xì)胞在體內(nèi)具有不受控增殖性,在體外培養(yǎng)中仍如此。正常二倍體細(xì)胞在體外培養(yǎng)中不加血清不能增殖,是因血清中含有很細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的因子,而癌細(xì) 胞在低血清中(2%~5%)仍能生長(zhǎng)。已證明腫瘤細(xì)胞有自泌或內(nèi)泌性產(chǎn)生促增殖因子能力。正常細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化后,出現(xiàn)能在低血清培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的現(xiàn)象,已成為 檢測(cè)細(xì)胞惡變的一個(gè)指標(biāo)。癌細(xì)胞或培養(yǎng)中發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化后的單個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),形成集落(克?。┑哪芰Ρ日<?xì)胞強(qiáng)。另外癌細(xì)胞增殖數(shù)量增多擴(kuò)展時(shí),接觸抑制 消除,細(xì)胞能相互重疊向三維空間發(fā)展,形成堆積物。 (三)永生性 永生性也稱不死性。在體外培養(yǎng)中表現(xiàn)為細(xì)胞可無(wú)限傳代而不凋亡(Apoptosis)。體外培養(yǎng)中的腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株都表現(xiàn)有這種性狀,體內(nèi)腫瘤 細(xì)胞是否如此尚無(wú)直接證明。因惡性腫瘤終將殺死宿主并同歸于盡,從而難以證明這一性狀的存在。體外腫癌細(xì)胞的永生性是否能反證它在體內(nèi)時(shí)同樣如此?也尚難 肯定。從近年建立細(xì)胞系或株的過(guò)程說(shuō)明,如果永生性是體內(nèi)腫瘤細(xì)胞所固有的,腫瘤細(xì)胞應(yīng)易于培養(yǎng)。事實(shí)上,多數(shù)腫瘤細(xì)胞初代培養(yǎng)時(shí)并不那么容易。生長(zhǎng)增殖 并不旺盛;經(jīng)過(guò)純化成單一化瘤細(xì)胞后,也大多增殖若干代后,便出現(xiàn)類似二倍體細(xì)胞培養(yǎng)中的停滯期。過(guò)此階段后才獲得永生性,順利傳代生長(zhǎng)下去。從而說(shuō)明體 外腫瘤細(xì)胞的永生性有可能是體外培養(yǎng)后獲得的。從一些具有永生性而無(wú)惡性性的細(xì)胞系,如NIH3T3、Rat-1、10T1/2等細(xì)胞證明,永生性和惡性 (包括浸潤(rùn)性)是兩種性狀,受不同基因調(diào)控,但卻有相關(guān)性??赡苡郎允羌?xì)胞惡變的階段。至少在體外是如此。 (四)浸潤(rùn)性 浸潤(rùn)性是腫瘤細(xì)胞擴(kuò)張性增殖行為,培養(yǎng)癌細(xì)胞仍持有這種性狀。在與正常組織混合培養(yǎng)時(shí),能浸潤(rùn)入其它組織細(xì)胞中,并有穿透人工隔膜生長(zhǎng)的能力。 (五)異質(zhì)性 所有腫瘤都是由有增殖能力、遺傳性、起源、周期狀態(tài)等性狀不同的細(xì)胞組成。異質(zhì)性構(gòu)成同一腫瘤內(nèi)細(xì)胞的活力有差別的瘤組織;處于瘤體周邊區(qū)的細(xì)胞獲 得血液供應(yīng)多,增殖旺盛,中心區(qū)有的細(xì)胞衰老退化,有的處于周期阻滯狀態(tài),那些呈活躍增殖狀態(tài)的細(xì)胞稱干細(xì)胞(Stem Cells)、只有這些干細(xì)胞才是支持腫瘤生長(zhǎng)的成分。腫瘤干細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)易于生長(zhǎng)增殖;把干細(xì)胞分離出來(lái)的培養(yǎng)方法稱干細(xì)胞培養(yǎng)。 (六)細(xì)胞遺傳 大多數(shù)腫瘤細(xì)胞有遺傳學(xué)改變,如失去二倍體核型、呈異倍體或多倍體等。腫瘤細(xì)胞群常由多個(gè)細(xì)胞群組成,有干細(xì)胞系和數(shù)個(gè)亞系,并不斷進(jìn)行著適應(yīng)性演變。 (七)其它 腫瘤細(xì)胞在體外不易生長(zhǎng)的原因可能由于: ①依賴性:腫瘤細(xì)胞雖有較強(qiáng)克隆生長(zhǎng)力,但仍有一定的群體性或與其它細(xì)胞相依存關(guān)系。一是腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞的相互依存,二是腫瘤細(xì)胞與基質(zhì)成纖維細(xì)胞的依賴。體外分散培養(yǎng)和排除成纖維細(xì)胞后也會(huì)同時(shí)消除或減弱這些依存關(guān)系,可能影響癌細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的活性; ②腫瘤細(xì)胞的自泌也會(huì)因分散培養(yǎng)而被稀釋,達(dá)不到腫瘤生長(zhǎng)的需求,降低腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖力; ③并非所有腫瘤細(xì)胞都有強(qiáng)的生長(zhǎng)活力和長(zhǎng)的Life Span,只有干細(xì)胞才有強(qiáng)的增殖生長(zhǎng)能力,但這些細(xì)胞數(shù)量很少; ④離體培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞可能需求與體內(nèi)相似的特殊生存條件。 有細(xì)胞增殖,傳若干代后停止生長(zhǎng)或衰退死亡; 傳數(shù)代后細(xì)胞增殖緩慢,經(jīng)過(guò)一段停滯期后,才又呈旺盛生長(zhǎng)狀態(tài),形成穩(wěn)定生長(zhǎng)的腫瘤傳代細(xì)胞系。 以上現(xiàn)象說(shuō)明腫瘤細(xì)胞對(duì)體外生存條件有較高的要求,并需經(jīng)過(guò)對(duì)新環(huán)境的適應(yīng)才能生長(zhǎng),因此欲獲得好的培養(yǎng)效果,不能局限于一般培養(yǎng)法,必須采用一些特殊的措施。 1、適宜底物:把經(jīng)過(guò)純化的細(xì)胞接種在不同的底物上,如鼠尾膠原底層、飼細(xì)胞層等。 2、生長(zhǎng)因子:應(yīng)用促細(xì)胞生長(zhǎng)因子,向培養(yǎng)液中增加一種或幾種促細(xì)胞生長(zhǎng)因子。根據(jù)細(xì)胞種類不同選用不同的促生長(zhǎng)物,常用有胰島素、氫化可的松、雌激素以及其它生長(zhǎng)因子。 為提高腫瘤細(xì)胞對(duì)體外培養(yǎng)環(huán)境的適應(yīng)力和增加有活力癌細(xì)胞(干細(xì)胞)的數(shù)量,可采用動(dòng)物體轉(zhuǎn)嫁接種成瘤后,再?gòu)膭?dòng)物體內(nèi)取出進(jìn)行培養(yǎng),能提高體外培養(yǎng)的成功率。受體動(dòng)物以裸鼠最好。 3、動(dòng)物體媒介培養(yǎng)方法: (1)瘤塊接種:取新鮮瘤組織,用Hanks液洗凈血污,切成1~3毫米小塊,用穿刺針頭吸一小瘤塊,用酒精棉球擦拭動(dòng)物腹部后,直接刺入皮下,注入瘤塊; (2)飼養(yǎng)觀察,待腫瘤生長(zhǎng)達(dá)較大體積后,剝?nèi)〕隽鼋M織; (3)進(jìn)行體外培養(yǎng)。 (4)為防止失敗,仍取部分瘤組織繼續(xù)在裸鼠體內(nèi)傳代。通過(guò)裸鼠媒介接種,有活力的腫瘤細(xì)胞數(shù)量增多,細(xì)胞培養(yǎng)易于成功。 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)方法與培養(yǎng)正常細(xì)胞完全相同,但成功率比正常細(xì)胞高。 第二節(jié) 培養(yǎng)方法 腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)成功關(guān)鍵在于:取材、成纖維細(xì)胞的排除、選用適宜的培養(yǎng)液和培養(yǎng)底物等幾個(gè)方面。在具體培養(yǎng)方法方面,腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)與正常組織細(xì)胞培養(yǎng)并無(wú)原則差別,初代培養(yǎng)應(yīng)用組織塊和消化培養(yǎng)法均可。 1、取材: 人腫瘤細(xì)胞來(lái)自外科手術(shù)或活檢瘤組織。取材部位非常重要,體積較大的腫瘤組織中有退變或壞死區(qū),取材時(shí)盡量避免用退變組織,要挑選活力較好的部位。癌性轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)或胸腹水是好的培養(yǎng)材料。取材后宜盡快進(jìn)行培養(yǎng),如因故不能立即培養(yǎng),可貯存于4℃中,但不宜栽過(guò)24小時(shí)。 2、培養(yǎng)基: 腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)基的要求不如正常細(xì)胞嚴(yán)格,一般常用的 RPMIl640、 DMEM、Mc-Coy5A等培養(yǎng)基等皆可用于腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)血清的需求比正常細(xì)胞低,正常細(xì)胞培養(yǎng)不加血清不能生長(zhǎng),腫瘤細(xì)胞在低血清培養(yǎng)基 中也能生長(zhǎng)。腫瘤細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)環(huán)境適應(yīng)性較大,是因腫瘤細(xì)胞有自泌(Autocrine)性產(chǎn)生促生長(zhǎng)物質(zhì)之故。但這并不說(shuō)明腫瘤細(xì)胞完全不需要這些成分。 按不同細(xì)胞需要不同的生長(zhǎng)因子;腫瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞之間、腫瘤細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞之間對(duì)生長(zhǎng)因子的需求都存在著差異。但大多數(shù)腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中仍需要生長(zhǎng)因子。 有的還需特異性生長(zhǎng)因子〔如乳腺癌細(xì)胞等)??傊囵B(yǎng)腫瘤細(xì)胞仍需加血清和相關(guān)生長(zhǎng)因子培養(yǎng)更易成功。 3、成纖維細(xì)胞的排除: 成纖維細(xì)胞常與腫瘤細(xì)胞同時(shí)混雜生長(zhǎng),致難以純化腫瘤細(xì)胞。而且成纖維細(xì)胞常比腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)得快,最終能壓制腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)。因此排除成纖維細(xì)胞成為腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)中的關(guān)鍵。排除成纖維細(xì)胞有多種方法(表2-1)。 表2-1 抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因素 注:上表結(jié)果為個(gè)別實(shí)驗(yàn)室經(jīng)驗(yàn),僅供參考 第三節(jié) 成纖維細(xì)胞排除法 1、機(jī)械刮除法: 是用不銹鋼絲末端插有橡膠刮頭(用膠塞剪成三角形插以不銹鋼絲)、或裹少許脫脂棉制成,裝入試管中高壓滅菌后備用(也可用特制電熱燒灼器刮除)。刮除程序?yàn)椋?/p> (1)標(biāo)記:鏡下觀察,用不脫色筆在培養(yǎng)瓶皿的背面圈下生長(zhǎng)腫瘤細(xì)胞的部位; (2)刮除:棄掉培養(yǎng)液,把無(wú)菌膠刮伸入瓶皿中,肉眼或顯微鏡窺視下,刮除無(wú)標(biāo)記空間; (3)用Hanks液沖洗一兩次,洗除被刮掉的細(xì)胞; (4)注入培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),如發(fā)現(xiàn)仍有成纖維細(xì)胞殘留,可重復(fù)刮除至完全除掉為止 2、反復(fù)貼壁法: 根據(jù)腫瘤細(xì)胞比成纖維細(xì)胞貼壁速度慢的特點(diǎn),并結(jié)合使用不加血清的營(yíng)養(yǎng)液,把含有兩類細(xì)胞的細(xì)胞懸液反復(fù)貼壁,使兩類細(xì)胞相互分離,操作方法與傳代相同。 (1)待細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)一定數(shù)量后,倒出舊培養(yǎng)液,用胰酶消化后,Hanks 沖洗2次,加入不含血清的培養(yǎng)液,吹打制成細(xì)胞懸液; (2)取編號(hào)為此A、B、C三個(gè)培養(yǎng)瓶;首先把懸液接種入A培養(yǎng)瓶中。置溫箱中靜止培養(yǎng)5~20分鐘后,輕輕傾斜培養(yǎng)瓶,讓液體集中瓶角后慢慢吸出全部培養(yǎng)液,再接種入B培養(yǎng)瓶中后;向A瓶中補(bǔ)充少許完全培養(yǎng)液置溫箱中繼續(xù)培養(yǎng); (3)培養(yǎng)B瓶中細(xì)胞5~20分鐘后,接處理A的方法,把培養(yǎng)液注入C培養(yǎng)瓶中;再向B瓶中補(bǔ)加完全培養(yǎng)基。 當(dāng)三個(gè)瓶?jī)?nèi)都含有培養(yǎng)液后,均在溫箱中繼續(xù)培養(yǎng)。如操作成功,次日觀察可見(jiàn)A瓶主要為成纖維細(xì)胞,B瓶?jī)深惣?xì)胞相雜,C瓶可能主要為癌細(xì)胞。必要時(shí)可反復(fù)處理多次,直至癌細(xì)胞純化為止。 3、消化排除法: 此法曾用于乳癌細(xì)胞的培養(yǎng),具體程序是: (1)先是用0.5%胰蛋白酶和0.02%EDTA(1:1)混合液漂洗培養(yǎng)細(xì)胞一次,然后再換成新的混合液繼續(xù)消化,并在倒置顯微鏡下窺視和不時(shí)搖動(dòng)培養(yǎng)瓶,到半數(shù)細(xì)胞脫落下來(lái)后,便立即停止消化; (2)把消化液吸入離心管中,離心去上清,吸入另瓶中,加培養(yǎng)液置溫箱中培養(yǎng);向原瓶?jī)?nèi)也補(bǔ)加新的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。用此法處理后,成纖維細(xì)胞比腫瘤細(xì)胞易先脫落。經(jīng)過(guò)幾次反復(fù)處理,可能把成纖維細(xì)胞除凈。 4、膠原酶消化法: 本法是利用成纖維細(xì)胞對(duì)膠原酶較為敏感的特點(diǎn),通過(guò)消化進(jìn)行選擇。 (1)可用0.5mg/ml的膠原酶消化處理,邊消化邊在倒置顯微鏡下窺視,當(dāng)發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞被除掉后,即終止消化; (2)用Hanks洗滌處理一次后,更換新培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng),可獲純凈腫瘤細(xì)胞。如成纖維細(xì)胞未被除凈,可再次重復(fù)。 5、其它方法: 有人發(fā)現(xiàn)聚丙烯酰胺有抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的作用;也有人用聚蔗糖制備成比重1.025~1.085的密度梯度離心液,加入細(xì)胞懸液后,在23℃中 800g離心 10分種。在比重1.025~1.050層為成纖維細(xì)胞,在比重1.050~1.085層為上皮細(xì)胞,再經(jīng)過(guò)分離進(jìn)行培養(yǎng)。最近也有人應(yīng)用特殊化學(xué)物如 SOD抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的方法。 選用上述任何一種方法,都需進(jìn)行試驗(yàn),取得必要經(jīng)驗(yàn),找出適合的條件,才能獲得好的效果。 第四節(jié) 提高腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)存活率和生長(zhǎng)率措施 根據(jù)人們的經(jīng)驗(yàn),腫瘤細(xì)胞在體外不易培養(yǎng),建立能傳代的腫瘤細(xì)胞系更為困難。當(dāng)腫瘤組織或細(xì)胞初代接種培養(yǎng)后,常出現(xiàn)以下幾種情況: 完全無(wú)細(xì)胞游出或移動(dòng); 有細(xì)胞移動(dòng)和游出,但無(wú)細(xì)胞增殖,細(xì)胞長(zhǎng)時(shí)間處于停滯狀態(tài)以致難以傳代; 第五節(jié) 體外培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè) 一旦培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)成形態(tài)上單一的細(xì)胞群體或細(xì)胞系(或株)后,不論用于實(shí)驗(yàn)研究還是建立細(xì)胞系,都需要做一系列的細(xì)胞生物學(xué)測(cè)定,主要的目的在于求得證明: 所培養(yǎng)的細(xì)胞系的確來(lái)源于原體內(nèi)具有惡性的細(xì)胞,而非正常細(xì)胞或其它細(xì)胞。均具有瘤種特異性。闡明一般生物學(xué)性狀。測(cè)定項(xiàng)目數(shù)量無(wú)明確規(guī)定,根據(jù)需要而定,以下為常做的項(xiàng)目和要點(diǎn)。 【形態(tài)觀察】主要觀察細(xì)胞的一般形態(tài),如大體形態(tài)、核漿比例、染色質(zhì)和核仁大小、多少等以及細(xì)胞骨架微絲微管的排列狀態(tài)等。 【細(xì)胞生長(zhǎng)增殖】檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線、細(xì)胞分裂指數(shù)、倍增時(shí)間、細(xì)胞周期時(shí)間。 【細(xì)胞核型分析】檢測(cè)核型特點(diǎn),染色體數(shù)量、標(biāo)記染色體的有無(wú)、帶型等。 【凝集試驗(yàn)】檢測(cè)凝集力。 【軟瓊脂培養(yǎng)】檢測(cè)集落形成能力。 【異體動(dòng)物接種】向異體動(dòng)物體內(nèi)(皮下)接種細(xì)胞懸液,觀察成瘤能力。 【其它】除上述項(xiàng)目外,根據(jù)需要還可做同位素標(biāo)記、組織化學(xué)成分分析,熒光顯微鏡觀察等。 在上述腫瘤細(xì)胞生物學(xué)檢測(cè)中,最主要的為:異體動(dòng)物(以用裸鼠為上)接種成瘤、軟瓊脂培養(yǎng)、核型分析、細(xì)胞骨架和電鏡觀察等幾項(xiàng)。當(dāng)然從分子細(xì)胞學(xué)角度考慮尚應(yīng)做癌基因和抗癌基因等的檢測(cè),這些項(xiàng)目將在本書第二篇中介紹。 第六節(jié) 對(duì)腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株的評(píng)價(jià) 已建成的各種腫瘤細(xì)胞系或細(xì)胞株,無(wú)疑都是可用的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。近年我國(guó)已建成的腫瘤細(xì)胞系已非常多,并獲得越來(lái)越廣泛的應(yīng)用。但根據(jù)研究者的經(jīng)驗(yàn),在 使用這些細(xì)胞系時(shí),應(yīng)持特別審慎態(tài)度,主要是應(yīng)考慮到這些細(xì)胞在長(zhǎng)期傳代中有否發(fā)生遺傳性改變的可能。眾所周知,長(zhǎng)期傳代細(xì)胞系染色體核型常是不穩(wěn)定的。 另外也可能發(fā)生如基因突變、基因易位或缺失等變化。其結(jié)果可能導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生生物學(xué)性狀上的變動(dòng)。以近年建成的各種腫瘤細(xì)胞系為例,都已傳代少則幾十,多則 百代以上后,才確認(rèn)建成了細(xì)胞系。這種情況下很難保證細(xì)胞從初代到建成時(shí)的性狀仍是一致的。 已如前述,癌細(xì)胞在培養(yǎng)中并非能很順利地傳下去,凡已長(zhǎng)期傳代的細(xì)胞系,都已獲得不死性。當(dāng)前尚未完全確證所有癌細(xì)胞都具有不死性;因此尚難肯定在 長(zhǎng)期培養(yǎng)中的癌細(xì)胞的生物學(xué)性狀與體內(nèi)時(shí)仍完全相同(包括不死性)。據(jù)上述對(duì)用癌細(xì)胞系所獲實(shí)驗(yàn)結(jié)果應(yīng)盡量做分析性的結(jié)論,避免做概括性的與體內(nèi)等同的結(jié) 論,外推與體內(nèi)等同更是不妥的。廣泛來(lái)說(shuō),應(yīng)用各種較長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)細(xì)胞做實(shí)驗(yàn)時(shí),都應(yīng)如此。 文章來(lái)源:丁香通、網(wǎng)絡(luò)
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